豬鏈球菌核酸檢測量值溯源研究及方法評(píng)估
關(guān)鍵詞：鏈球菌 豬 熒光定量pcr 量值溯源
摘要：目的針對(duì)病原微生物檢測中急需解決的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)和量值溯源問題，建立豬鏈球菌核酸量值熒光定量PCR方法，研制豬鏈核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，探索等效一致的核酸測量技術(shù)。方法根據(jù)已報(bào)告的DNA序列設(shè)計(jì)并合成種特異性16SrRNA引物，建立熒光定量WaR方法，摸索最佳上、下游引物配比濃度，利用已知核酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得0值與樣本起始拷貝數(shù)的關(guān)系，對(duì)方法的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性和不確定性進(jìn)行評(píng)估，并進(jìn)行DNA標(biāo)準(zhǔn)品效期實(shí)驗(yàn)。結(jié)果建立的豬鏈球菌DNA實(shí)時(shí)定量PCR方法，最佳引物濃度為上游0．6μmoL／L，下游0．3μmol／L。方法的靈敏度為18．6DNA拷貝數(shù)，DNA最佳檢出濃度為1．86×102—1．86×104拷貝／10vL反應(yīng)體系。0值只與模板的DNA起始濃度有關(guān)（F：597．60，P〈0．01），與不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)間及實(shí)驗(yàn)人員（F=0．60、1．90，P〉0．05）無關(guān)。0值的不確定度為0．46％～5．40％。DNA標(biāo)準(zhǔn)品4oC可保存半年以上，而一60℃保存則可達(dá)1年以上。結(jié)論建立的熒光定量PCR方法特異性及穩(wěn)定性良好，可用于豬鏈球菌核酸量值測定；制備的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具備國際計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，且穩(wěn)定性好，可作為豬鏈球菌核酸檢測的量值溯源和傳遞示范的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
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