小麥TaWTG1的原核表達(dá)、純化及去泛素化酶活性分析
關(guān)鍵詞：小麥 tawtg1 原核表達(dá) 純化 去泛素化酶活性
摘要：去泛素化酶是泛素化途徑的逆調(diào)節(jié)酶,參與調(diào)控蛋白質(zhì)的降解。為了探索小麥(Triticum aestivum)去泛素化酶家族成員WTG1 (wide and thick grain 1)基因的功能,本研究利用生物信息學(xué)方法對小麥TaWTG1編碼蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析;進(jìn)一步構(gòu)建其原核表達(dá)載體p ET28a-TaWTG1,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)菌株BL21(DE3),對重組蛋白His-TaWTG1誘導(dǎo)表達(dá)條件(包括培養(yǎng)溫度,異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)濃度和誘導(dǎo)時間)進(jìn)行優(yōu)化;進(jìn)一步對重組蛋白進(jìn)行可溶性分析和鎳柱分離純化,并對其去泛素化活性進(jìn)行體外驗(yàn)證。結(jié)果表明,TaWTG1蛋白由319個氨基酸組成,理論分子量為35.38 kD,等電點(diǎn)為4.62;其三級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋構(gòu)成,含有OTU (ovarian tumor-related proteases)相關(guān)蛋白酶家族的otubain保守結(jié)構(gòu)域;重組蛋白His-TaWTG1的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.4 mmol/L IPTG、28℃誘導(dǎo)6 h;該重組蛋白主要以可溶形式存在于上清液中。Western blot分析確定用鎳柱分離純化獲得的重組蛋白為目的蛋白;體外活性分析實(shí)驗(yàn)表明,TaWTG1具有去泛素化酶活性,可以切割賴氨酸(K)48和K63連接的四聚泛素鏈。本研究為TaWTG1基因功能研究提供了基礎(chǔ)資料。
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