敲除RIG-I基因的PK-15細(xì)胞系的建立及RIG-I對豬圓環(huán)病毒2型感染的作用
關(guān)鍵詞：視黃酸誘導(dǎo)基因i信號通路 豬圓環(huán)病毒2型
摘要：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建敲除RIG-I基因的PK-15細(xì)胞,初步探究視黃酸誘導(dǎo)基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)對豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)了針對豬RIG-I基因的2條sgRNA,構(gòu)建重組載體pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀分選單細(xì)胞、測序、Western blot檢測RIG-I敲除情況。PCV2感染細(xì)胞后,通過熒光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR檢測病毒增殖水平。結(jié)果顯示,篩選出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15細(xì)胞,Western blot檢測RIG-I蛋白不表達(dá)。PCV2感染正常PK-15細(xì)胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上調(diào),表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下調(diào)MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15細(xì)胞中復(fù)制,初步表明RIG-I信號通路促進(jìn)PCV2在PK-15細(xì)胞中復(fù)制。本研究為PCV2感染的天然免疫機(jī)制研究提供了良好的細(xì)胞模型。
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