新城疫P蛋白磷酸化位點(diǎn)的質(zhì)譜分析和功能鑒定
關(guān)鍵詞：新城疫病毒 質(zhì)譜 微型基因組 磷酸化位點(diǎn)
摘要：副黏病毒磷蛋白,即P蛋白(phosphoprotein),富含絲氨酸和蘇氨酸,在自然條件下磷酸化水平較高。副黏病毒P蛋白的磷酸化對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制具有重要的作用,但新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P蛋白磷酸化位點(diǎn)及其功能依然尚不明確。本研究通過(guò)LC-MS/MS質(zhì)譜對(duì)NDV La Sota病毒P蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè),鑒定了Ser56、Ser77、Thr78、Thr82、Ser164和Ser141六個(gè)磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)在線分析,預(yù)測(cè)這些磷酸化位點(diǎn)的磷酸化激酶分別是PKC、CKII和GSK3。為了鑒定6個(gè)磷酸化位點(diǎn)的生物學(xué)功能,在已建立的表達(dá)GFP基因的NDV微型基因組質(zhì)粒pTVT-LGT基礎(chǔ)上,用熒光素酶報(bào)告基因(luciferase)替換GFP報(bào)告基因,建立了表達(dá)熒光素酶的NDV微型基因組系統(tǒng)。利用“丙氨酸掃描”對(duì)6個(gè)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變后,在NDV微型基因組平臺(tái)中進(jìn)行功能鑒定。結(jié)果顯示,T78、T82和S164位磷酸化位點(diǎn)的缺失顯著影響了病毒RNA依賴性RNA聚合酶復(fù)合體(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)的復(fù)制,其生物學(xué)意義有待進(jìn)一步的研究。
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