利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Lrtm1基因敲除的C2C12細(xì)胞系
關(guān)鍵詞：lrtm1 基因敲除 c2c12
摘要：目的:利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定敲除Lrtm1(leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1)基因的C2C12細(xì)胞系,為研究Lrtm1基因的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:設(shè)計(jì)3對針對Lrtm1基因的向?qū)NA(sgRNA),將sgRNA插入載體pCRISPRLvSG06中;利用慢病毒包裝系統(tǒng)包裝含有sgRNA的重組質(zhì)粒pCRISPR-LvSG06;將病毒感染C2C12細(xì)胞,并加入嘌呤霉素篩選,將篩選嘌呤霉素陽性的細(xì)胞提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA;設(shè)計(jì)Cas9引物,利用cDNA為模版,PCR驗(yàn)證C2C12細(xì)胞中Cas9的表達(dá),確認(rèn)慢病毒成功感染C2C12細(xì)胞;利用96孔板挑選單克隆細(xì)胞的方法篩選得到單克隆細(xì)胞;將擴(kuò)增的單克隆細(xì)胞提取基因組DNA,測序Lrtm1基因相關(guān)序列并與野生型Lrtm1基因進(jìn)行對比,確認(rèn)敲除成功的克隆細(xì)胞株;誘導(dǎo)敲除Lrtm1穩(wěn)定細(xì)胞株成肌分化,檢測成肌分化標(biāo)志因子Myosin的蛋白表達(dá),RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子PAX7的mRNA表達(dá),Western blot檢測H3K27me3蛋白水平。結(jié)果:測序結(jié)果顯示向?qū)NA(sgRNA)成功插入載體質(zhì)粒;將單克隆細(xì)胞DNA測序結(jié)果顯示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化標(biāo)志因子Myosin蛋白表達(dá)降低,成肌轉(zhuǎn)錄因子PAX7 mRNA的表達(dá)降低,在分化72和96 h組,H3K27me3蛋白水平較野生型組增高。結(jié)論:利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除Lrtm1基因,穩(wěn)定敲除Lrtm1基因的C2C12細(xì)胞系構(gòu)建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12細(xì)胞成肌分化,并且抑制成肌轉(zhuǎn)錄因子PAX7的m RNA表達(dá),PAX7mRNA表達(dá)降低的原因可能為H3K27me3水平增高。
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