導(dǎo)言：作為寫作愛好者，不可錯過為您精心挑選的10篇大一學(xué)習(xí)計(jì)劃書，它們將為您的寫作提供全新的視角，我們衷心期待您的閱讀，并希望這些內(nèi)容能為您提供靈感和參考。

篇1

聲樂班以提高學(xué)生的音樂綜合素質(zhì)與興趣為目的，通過形象生動的教學(xué)形式，使學(xué)員了解歌唱基本原理，掌握一定的音樂基礎(chǔ)知識和歌唱的基本技能，激發(fā)學(xué)員熱愛音樂藝術(shù)，培養(yǎng)學(xué)員正確的審美意識與積極、健康、活潑、向上的審美情趣。教學(xué)內(nèi)容包括基本歌唱發(fā)聲技巧、視唱練耳、基本樂理、歌唱表演，歌唱姿態(tài)與舞臺風(fēng)度。

二、 輔導(dǎo)方法：

統(tǒng)一視唱練耳練習(xí)：每周一中午12點(diǎn)40，教學(xué)樓108教室，由王老師統(tǒng)一帶領(lǐng)練習(xí)；或由器樂組同學(xué)幫助在飯?zhí)萌龢乔俜烤毩?xí)。

聲樂組成員自主練習(xí)時(shí)間：每周2晚7點(diǎn)在飯?zhí)萌龢乔俜浚ǔ蓡T也可以根據(jù)自己的實(shí)際情況在課外活動時(shí)間練習(xí)）。

訓(xùn)練統(tǒng)一發(fā)音位置，練習(xí)合理呼吸，咬字吐字清晰，聲音獨(dú)立穩(wěn)定。練習(xí)曲以簡到難，有小到大，循序漸進(jìn)。

三、小組成員的考核：

篇2

關(guān)鍵詞：頭頂一顆株； 學(xué)習(xí)； 記憶； 抗氧化酶； 超氧化物歧化酶； 谷胱甘肽過氧化物酶

Effects of Trillium tschonoskii Maxim on Learning and Memory and Anti-oxidase in Rats

Abstract：ObjectiveTo study the effect of Trillium tschonoskii Maxim injection on the learning and memory and on the expression of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in serum， liver， kidney， hippocampus， cortex of aging rats.MethodsRats were randomly pided into five groups， control group， model group， Trillium tschonoskii maxim injection small dose group， middle dose group and large dose group. Rat model of acquired memory deficiency induced with haloperidol was employed. Electricity stimulated jumping stand was used for observation on rat behavior change and meanwhile concentrations of SOD and GSH-Px in different organs of the animal were detected.ResultsIn contrast with model groups， Trillium tschonoskii maxim injection at different dosage could maintain learning and memory， significantly increase the concentrations of SOD and GSH-Px in different tissue of the rats.(P

Key words：Trillium tschonoskii Maxim; Learning； Memory； Anti-oxidase； Superoxid dismutase; Glutathione peroxidase

頭頂一顆株又稱延齡草Trillium tschonoskii Maxim，為百合科延齡草屬植物，以根入藥，含有薯蕷皂素、甾醇、甾酮等化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)靜、止痛、止血作用，主要用于治療眩暈頭痛、神經(jīng)衰弱、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、崩漏等疾?。?］。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能退行性病變是人體衰老的關(guān)鍵，并與代謝產(chǎn)生的氧自由基（oxygen free radicals）慢性損傷或抗氧化酶不足密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用頭頂一顆株注射液腹腔注射，通過對各組大鼠行為學(xué)觀察和組織SOD，GSH-Px含量測定，探討頭頂一顆株注射液對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及抗氧化酶的影響，從而進(jìn)一步探討其改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能抗衰老作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 頭頂一顆株注射液制備頭頂一顆株由恩施中藥材生產(chǎn)GAP（質(zhì)量管理規(guī)范）示范基地提供，采用水提醇沉法制成含生藥30%的注射液，瓶裝密封消毒備用。

1.2 藥品與儀器氟哌啶醇注射液(湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))， SOD、GSH-Px試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供），回避反應(yīng)箱（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理系提供），GL-20G II型高速低溫離心機(jī)，UV-2450分光光度儀，水浴箱。

1.3 電跳臺行為學(xué)訓(xùn)練及測試實(shí)驗(yàn)裝置為30 cm×30 cm回避反應(yīng)箱，箱底為銅柵，可通刺激電流。另有一高5 cm，頂端直徑為5 cm的橡膠圓臺作為避電擊平臺，固定放置在箱內(nèi)一角的銅柵上，大鼠可在圓臺上停留以回避電擊。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，先將大鼠輕放于回避反應(yīng)箱內(nèi)，使其適應(yīng)3~5 min，以消除探究反應(yīng)。爾后底部銅柵通電（36 V）2 s，大鼠在受電擊刺激中逐漸學(xué)會跳上平臺回避電擊。多數(shù)大鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又重新跳回平臺，如此訓(xùn)練3 min，并記錄每只鼠受電擊數(shù)或犯錯次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。末次給藥后，再測試行為學(xué)改變，記錄3 min各鼠跳下平臺的錯誤次數(shù)和第一次跳下平臺的潛伏期。

1.4 動物分組與用藥雄性Wistar大鼠50只，鼠齡40~50周，體重300~350 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。隨機(jī)分為對照組、模型組、頭頂一顆株高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10 只。模型組按1 g/kg體重腹腔注射氟哌啶醇注射液，頭頂一顆株高、中、低劑量組分別在注射氟哌啶醇的同時(shí)，按7.2，3.6，1.8 g/kg體重腹腔注射頭頂一顆株注射液，對照組每天等量腹腔注射生理鹽水，Bid，連續(xù)用藥7 d。

1.5 組織SOD，GSH-Px測定行為學(xué)測試結(jié)束后斷頸處死大鼠，迅速取血及各種組織，血液離心取血清，組織制成10%勻漿，備用。SOD，GSH-Px測定，按試劑盒說明書進(jìn)行，蛋白定量采用雙縮脲法測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法所有結(jié)果都用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，在對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的過程中，發(fā)現(xiàn)個別數(shù)據(jù)不符合ANOVA比較的要求，而用非參數(shù)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 頭頂一顆株對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 電跳臺行為學(xué)測試結(jié)果顯示，頭頂一顆株各劑量組與模型組比較均能延長實(shí)驗(yàn)大鼠的跳臺潛伏時(shí)間，減少3 min犯錯次數(shù)， 高、中劑量尤其明顯(P

2.2 頭頂一顆株對大鼠血及組織SOD，GSH-Px影響從表2和表3可見：頭頂一顆株注射液各劑量組與模型組比較均能提高血液、海馬、腦皮質(zhì)及肝腎SOD，GSH-Px表達(dá)值，高、中劑量組作用明顯(P

表1 頭頂一顆株對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（略）

與模型組比較，*P

表2 頭頂一顆株對大鼠血及組織SOD的影響（略）

與模型組比較，*P

表2 頭頂一顆株對大鼠血及組織GSH-Px的影響 （略）

與模型組比較，*P

3 討論

衰老（Senility）是人體一種全身性生理變化過程，各系統(tǒng)、器官、組織和細(xì)胞都會出現(xiàn)這種過程，其機(jī)制復(fù)雜，并與多種因素有關(guān)。Lustbader等研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激通過氧自由基損傷神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或死亡，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能減退［2］。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶系，普遍存在于人體各組織中，包括血液、肝臟、線粒體和細(xì)胞質(zhì)，有對抗自由基損傷和清除氧自由基、降低細(xì)胞內(nèi)H2O2水平、減少自由基和過氧化物蓄積的作用。氧自由基被SOD轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2后，GSH-Px可繼續(xù)作用在H2O2上，使之轉(zhuǎn)變成完全無害的水和氧。因此SOD，GSH-Px表達(dá)變化，已成為檢測衰老因素最為敏感和可靠的指標(biāo)［3］。已有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，根據(jù)氟哌啶醇可使實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生僵住癥(強(qiáng)直性昏厥，catalepsy)的原理，用氟哌啶醇進(jìn)行大鼠腹腔注射，對SOD和GSH-Px有抑制作用，是很好的動物老化造模劑［4］。本實(shí)驗(yàn)用氟哌啶醇造模，觀察、探討頭頂一顆株對大鼠行為學(xué)變化及在不同組織對SOD，GSH-Px表達(dá)作用的影響，結(jié)果表明：頭頂一顆株能維持實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，顯著提高實(shí)驗(yàn)大鼠血、肝、腎、海馬、腦皮質(zhì)SOD，GSH-Px表達(dá)量，具有上調(diào)抗氧化酶表達(dá)、改善記憶抗衰老作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 謝宗萬，范崔生，朱兆儀，等. 全國中草藥匯編，第2版［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：225.

篇3

1 材料與方法

11 黨參注射液制備

富硒板黨［恩施板橋鄉(xiāng)中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)示范基地］。采用水提醇沉法制成含生藥30％的注射液，瓶裝密封消毒備用。用雙道束原子熒光光譜法測定硒的含量為072?μg/ml。

12 藥品及實(shí)驗(yàn)儀器

氟哌啶醇注射液(湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司)；SOD、GSHPx試劑盒(南京建成生物工程研究所)；回避反應(yīng)箱(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院自制)；GL20G II型高速低溫離心機(jī)，UV2450分光光度儀，水浴箱。

13 大鼠電跳臺行為學(xué)訓(xùn)練及測試

跳臺實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)〔3〕進(jìn)行。末次給藥15?min后將大鼠輕放于回避反應(yīng)箱內(nèi)訓(xùn)練，適應(yīng)環(huán)境3?min，隨后底部銅柵通電(36V)2?s，訓(xùn)練時(shí)間為3?min。24?h后再進(jìn)行行為學(xué)測試，記錄各鼠第一次跳下平臺的潛伏期和3?min跳下平臺的錯誤次數(shù)。

14 實(shí)驗(yàn)動物分組

雄性Wistar大鼠50只，鼠齡40～50周，體重300～350?g(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心)，隨機(jī)分為對照組、模型組、富硒板黨高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。模型組按1?g/(kg·bw)腹腔注射氟哌啶醇注射液，富硒板黨高、中、低劑量組分別在注射氟哌啶醇的同時(shí)，按72，36，18?g/(kg·bw)腹腔注射富硒板黨注射液，對照組每天等量腹腔注射生理鹽水，各組用藥為2次/d注射，連續(xù)用藥7?d。實(shí)驗(yàn)動物造模參照文獻(xiàn)〔4〕。

15 SOD、GSHPx測定

行為學(xué)測試結(jié)束后斷頸處死大鼠，迅速取血及各種組織，血液離心取血清，組織制成10％勻漿，備用。SOD、GSHPx測定，按試劑盒說明書進(jìn)行，蛋白定量采用雙縮脲法測定。

16 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS115統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，對不符合ANOVA的數(shù)據(jù)，用非參數(shù)檢驗(yàn)(KruskaiWallis Test)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

21　富硒板黨對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

富硒板黨各劑量組與模型組比較均能延長實(shí)驗(yàn)大鼠的跳臺潛伏時(shí)間，減少3?min犯錯次數(shù)，高、中劑量尤其明顯(P

22 富硒板黨對大鼠血及組織SOD、GSHPx影響

富硒板黨注射液各劑量組與模型組比較均能提高血液、海馬、腦皮質(zhì)及肝腎SOD、GSHPx表達(dá)值，高、中劑量組作用明顯(P

3 討 論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，體內(nèi)自由基的濃度與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，隨著年齡的增加，由于抗氧化酶活性不斷下降，體內(nèi)產(chǎn)生的過量氧自由基無法及時(shí)清除，造成細(xì)胞代謝和功能形態(tài)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞的衰老。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶系，能清除氧自由基、降低細(xì)胞內(nèi)H2O2水平、減少自由基和過氧化物蓄積導(dǎo)致的細(xì)胞毒性作用〔5〕。肖本見等研究表明，富硒板黨能減弱苯異丙腺苷致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，對小鼠具有益智和抗氧化作用〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富硒板黨能減弱氟哌啶醇致大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，維持實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，顯著提高實(shí)驗(yàn)大鼠血、肝、腎、海馬、腦皮質(zhì)SOD、GSHPx的表達(dá)量，與肖本見等〔6〕的研究一致，說明富硒板黨具有清除氧自由基、改善記憶抗衰老、預(yù)防老年性癡呆等作用。其作用機(jī)制可能與富硒板黨所含膽堿、多糖及微量元素硒有關(guān)。為進(jìn)一步開發(fā)及其臨床應(yīng)用、健康保健等方面提供了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

〔1〕殷智.黨參商品名稱辨析［J］.湖北中醫(yī)雜志，2001，23(11)：49-50.

〔2〕肖培根.新編中藥志［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001，1：811-812.

〔3〕H Gerhard vogel(著)，杜冠華(譯).藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南—新藥發(fā)現(xiàn)和藥理學(xué)評價(jià)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：444-445.

篇4

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.07.015

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2013）07-0038-05

Change of Capillary Pericapillary Cells in Rats with Myocardial Infarction and Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Herbs HUANG Kun， YANG Dan-dan， GUO Shu-wen， SUN Qing， ZHANG Lu， QI Xin， WAN Ting， ZHENG Cheng-long （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029 ， China）

Abstract：Objective To observe the change of capillary pericapillary cells in rats with myocardial infarction and the influence of supplementing qi and activating blood circulation herbs， and explore its mechanism of improving myocardial perfusion. Methods The rat model was established by ligaturing the left anterior descending coronary artery. On the base of ECG evaluation， successfully modeled rats were randomly divided into the model group， group treated with supplementing qi and activating blood circulation Chinese medicine （activating blood and supplementing qi group）， group treated with Perindopril （Perindopril group）， group treated with Tongxinluo Capsules （Tongxinluo group）. The sham-operation group was taken as the control. There were totally 5 groups. The model group and the sham-operation group were treated with normal saline. The changes of myocardial capillary density （MCD） and number of pericapillary cells on the 7th， 28th day after medicinal administration were observed. Results On the 7th and 28th day， the MCD decreased significantly and the number of capillary pericapillary cells increased significantly in the model group compared with the sham-operation group （P

Key words：supplementing qi and activating blood circulation herbs；myocardial capillary density；number of pericapillary cells；myocardial infarction；rats

研究顯示，心肌梗死患者雖然經(jīng)過搭橋或支架置入術(shù)后使梗死相關(guān)冠脈再通，或經(jīng)冠脈造影證實(shí)已達(dá)TMI3級血流的梗

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81173142）

通訊作者：郭書文，E-mail：

死相關(guān)血管，有超過25%的患者心肌組織水平的血流灌注并未恢復(fù)[1]。因此，減少缺血心肌再灌注損傷、保持心肌微血管的完整性、改善缺血心肌血供狀態(tài)、恢復(fù)心肌細(xì)胞功能，是目前研究的熱點(diǎn)問題。

前期的系列研究結(jié)果顯示，益氣活血方能明顯促進(jìn)大鼠缺血心肌微血管生成而改善心肌缺血，并能抑制心肌細(xì)胞凋亡，對相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子有顯著調(diào)節(jié)作用[2-4]。本研究采用結(jié)扎冠狀動脈的方法建立大鼠急性心肌梗死后心衰模型，利用免疫組織化學(xué)方法觀察模型大鼠心肌毛細(xì)血管周細(xì)胞的變化，以及益氣活血中藥對其的影響，進(jìn)一步探討益氣活血中藥改善心肌血流灌注的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，清潔級，8周齡，中國科學(xué)院動物研究所提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物

益氣活血藥由黃芪、人參、當(dāng)歸、川芎、三七粉等組成。根據(jù)前期研究結(jié)果[5-6]選擇益氣活血藥（2∶1）的劑量組合[5-6]。依口服劑工藝制備，按處方比例稱取中藥材，加9倍量水，煎煮2次，每次2.5 h，共5 h，水煎液過濾，濃縮，加乙醇調(diào)含醇量至50%，過濾，回收乙醇，過濾，調(diào)整濃度為相當(dāng)原藥材2 g/mL，北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠提供。

對照藥物選用通心絡(luò)膠囊，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號110723-120116；培哚普利片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號P2009971052951。

1.3 試劑與儀器

BA3414 兔抗鼠CD34抗體（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品），BM0002小鼠抗α-SMA抗體（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品），血清內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO），南京建成生物工程公司提供。RSP1002型小動物呼吸機(jī)（Kent Scientific Corporation）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎方法[7]。用1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，背位固定，行氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)，在左側(cè)第3、4肋間切開皮膚，鈍性分離肌層，打開胸腔，用開胸器推開胸腺擴(kuò)大手術(shù)視野，充分暴露心臟，用帶線縫合針在左心耳與肺動脈圓錐之間于左心耳下約2 mm處，無張力的狀態(tài)下將左前降支連同少量的心肌組織一起結(jié)扎，然后迅速將心臟復(fù)位，關(guān)閉胸腔。全部手術(shù)過程在30 min內(nèi)完成，嚴(yán)格無菌操作。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素預(yù)防感染。以結(jié)扎部位以下心肌變灰白、搏動減弱、心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上明顯抬高為造模成功的標(biāo)志。假手術(shù)組手術(shù)過程相同，僅繞過左冠狀動脈，打松結(jié)。

2.2 分組與給藥

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、中藥組、培哚普利組、通心絡(luò)組。

各組于造模的第1日開始分別灌胃相應(yīng)藥物，每日1次。通心絡(luò)組每日給予通心絡(luò)膠囊30 mg/kg體質(zhì)量，培哚普利組每日給予培哚普利片0.72 mg/kg體質(zhì)量，益氣活血組每日給予益氣活血中藥21 g/kg體質(zhì)量[5-6]。各干預(yù)藥物均溶于無菌蒸餾水中，在保證藥物劑量的前提下，調(diào)整濃度使每只動物給藥容積均為10 mL/（kg?d）。假手術(shù)組和模型組每日以相同容積無菌蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃28 d。

2.3 標(biāo)本采集

稱取大鼠體質(zhì)量，用1%戊巴比妥鈉麻醉，剪開腹腔，從腹主動脈取血，分離出血清待測。然后剪斷肋骨和胸肌，暴露胸腔取出心臟，用生理鹽水洗去血污，剔除血管、脂肪等非心肌組織，從左心室最大橫徑處切開，將切好的下半部分心臟放入預(yù)先準(zhǔn)備的4%多聚甲醛液中固定備用，進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)方法處理，制作石蠟切片。據(jù)各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的成活數(shù)量分別觀察第7、28日2個時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的變化情況。

2.4 心肌病理形態(tài)學(xué)觀察

將心肌組織用不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片，脫臘，二甲苯透明，HE常規(guī)染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固，光學(xué)顯微鏡觀察。

2.5 心肌毛細(xì)血管密度

石蠟切片脫蠟至水；3%過氧化氫室溫孵育8 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗3次（每次2 min），電爐加熱沸騰后斷電，間隔7 min，反復(fù)2次，冷卻后PBS（pH 7.2～7.6）洗滌2次，滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加CD34一抗（濃度為1∶100），4 ℃過夜，第2日早晨滴加生物素山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗3次（每次2 min），滴加SABC，室溫20 min，PBS洗4次（每次5 min），DAB顯色，取1 mL蒸餾水，A、B、C試劑各加1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制時(shí)間，蒸餾水沖洗，蘇木素輕度復(fù)染，1～2 s即可，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2.6 免疫組化染色法檢測周細(xì)胞

石蠟包埋，切片（厚度4 ?m，每只鼠各取3張切片），脫蠟，高溫高壓抗原修復(fù)，噴氣后計(jì)時(shí)2 min，自然冷卻，水洗。4 ℃下于1∶300 α-SMA單克隆抗體孵育24 h，每張切片滴加50 ?L EnVisionTM試劑，室溫下孵育30 min。滴加新鮮配制的顯色劑（DAB），蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察，胞漿顯棕黃色者為陽性細(xì)胞。按下法計(jì)數(shù)：先在100×視野下隨機(jī)選擇血管密度高的5個區(qū)和血管密度低的5個區(qū)作為計(jì)數(shù)部位，后在400×視野下計(jì)數(shù)微血管旁胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒的周細(xì)胞數(shù)，每只大鼠計(jì)數(shù)20個視野，最后以平均每個視野（400×）的周細(xì)胞數(shù)表示。小動脈平滑肌細(xì)胞亦為α-SMA陽性表達(dá)，根據(jù)血管壁厚度及結(jié)構(gòu)可與周細(xì)胞相區(qū)別，此類陽性細(xì)胞不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。

2.7 血清內(nèi)皮素-1、一氧化氮測定

采用雙抗體夾心ELISA法測定各組大鼠血清ET-1、NO的變化，具體方法嚴(yán)格按試劑盒說明操作。根據(jù)各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的成活數(shù)量分別觀察第7、28日2個時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的變化情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。一般資料采用描述性分析，計(jì)量資料以―x±s表示，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及百分?jǐn)?shù)描述；多個樣本計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料符合正態(tài)性分布采用t檢驗(yàn)，如不符合正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，比較各項(xiàng)指標(biāo)在治療前后之間的差異，多組間差異性統(tǒng)計(jì)采用方差分析，若方差不齊，則用Games-Howell分析，雙側(cè)檢驗(yàn)。P

4 結(jié)果

4.1 模型建立情況

采用冠狀動脈結(jié)扎法致大鼠急性心肌梗死后，肢導(dǎo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段呈弓背向上抬高，缺血心肌很快變蒼白色。共手術(shù)100只，造模成功81只，死亡19只，其中手術(shù)中死亡8只，急性心肌梗死造模成功后24 h內(nèi)死亡3只，給予藥物治療后死亡3只，注射麻藥后行心臟超聲檢查后死亡5只，死亡原因?yàn)楹粑Ｖ?、室顫和大出血，造模成功?1.0%。第7日觀察大鼠42只，第28日觀察大鼠39只。

4.2 各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)觀察

第7日：假手術(shù)組大鼠心外膜未見纖維素滲出及未見炎細(xì)胞浸潤；模型組心肌梗死區(qū)炎癥反應(yīng)明顯，有泡沫狀組織細(xì)胞聚集，大量中性粒細(xì)胞浸潤，心肌纖維斷裂、排列紊亂，壞死的心肌組織由新生的肉芽組織取代；梗死區(qū)邊緣有充血、出血及炎細(xì)胞帶，心外膜有炎性及纖維素性滲出物。培哚普利組病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小。通心絡(luò)組病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，較培哚普利組病變范圍小。益氣活血組病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，較培哚普利組及通心絡(luò)組病變范圍較小。見圖1。

第28日：假手術(shù)組大鼠心外膜未見纖維素滲出及未見炎細(xì)胞浸潤。模型組大鼠心肌梗死區(qū)由纖維母細(xì)胞、纖維細(xì)胞及致密的膠原纖維束組成，呈束狀或平行排列，膠原纖維束之間有極少殘存的心肌組織，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，地圖狀瘢痕組織形成；心室腔擴(kuò)大，室壁變薄。培哚普利組大鼠病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，且梗死區(qū)有島狀或細(xì)帶狀的心肌組織。通心絡(luò)組大鼠病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，且梗死區(qū)有島狀或細(xì)帶狀的心肌組織，但較培哚普利組病變范圍大。益氣活血組大鼠病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，且梗死區(qū)有島狀或細(xì)帶狀的心肌組織，但較培哚普利組病變范圍大。見圖2。

假手術(shù)組 模型組

益氣活血組 培哚普利組 通心絡(luò)組

圖1 第7日HE染色大鼠心肌病理形態(tài)（×50）

假手術(shù)組 模型組

益氣活血組 培哚普利組 通心絡(luò)組

圖2 第28日HE染色大鼠心肌病理形態(tài)（×100）

4.3 益氣活血中藥對心肌梗死大鼠血清內(nèi)皮素-1、一氧化氮水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ET-1含量明顯升高，NO水平下降（P

表1 各組大鼠血清ET-1、NO水平比較（―x±s，pg/mL）

組別 術(shù)后第7日 術(shù)后第28日

只數(shù) ET1 NO 只數(shù) ET1 NO

假手術(shù)組 10 5.37±1.06 31.12±2.57 9 6.38±1.73 30.38±4.00

模型組 7 13.67±1.68## 19.41±3.24## 7 14.60±2.38## 16.23±3.05##

益氣活血組 9 8.06±1.21** 41.71±4.43** 8 8.97±1.07** 40.11±5.51**

培哚普利組 8 10.65±1.12** 33.02±2.68** 8 7.30±1.37** 45.26±6.60**

通心絡(luò)組 8 9.87±0.73** 37.76±3.34** 7 9.57±1.57** 35.06±5.20**

注：與假手術(shù)組比較，##P

4.4 益氣活血中藥對心肌梗死大鼠毛細(xì)血管密度的影響

在病理圖像分析系統(tǒng)下測定各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)平均毛細(xì)血管密度（MCD）。第7日：模型組較假手術(shù)組心肌梗死邊緣區(qū)MCD明顯降低（P

表2 各組大鼠心肌MCD比較（―x±s）

組別 n 第7日 第28日

假手術(shù)組 20 612.79±33.35 611.11±25.67

模型組 20 533.67±20.27## 493.27±19.38##

益氣活血組 20 1178.50±33.27** 1051.30±30.12**

培哚普利組 20 1010.10±33.27** 1099.30±33.98**

通心絡(luò)組 20 1094.30±33.12** 974.75±35.41**

4.5 益氣活血中藥對心肌梗死大鼠毛細(xì)血管周細(xì)胞計(jì)數(shù)影響

第7日：模型組較假手術(shù)組心肌梗死邊緣區(qū)周細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，益氣活血中藥組、培哚普利組、通心絡(luò)組與模型組比較，梗死邊緣區(qū)的周細(xì)胞計(jì)數(shù)減少（P

表3 各組大鼠心肌周細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（―x±s，個）

組別 n 第7日 第28日

假手術(shù)組 20 0.8±0.84 1.2±0.84

模型組 20 8.2±1.30## 14.0±1.58##

益氣活血組 20 4.2±0.84* 4.4±1.14**

培哚普利組 20 5.8±0.84** 3.6±1.14**

通心絡(luò)組 20 4.4±0.55** 5.8±1.30**

注：與益氣活血組比較，P

P

5 討論

臨床研究表明，急性心肌梗死患者多存在“氣虛血瘀”的中醫(yī)病理[8]。實(shí)驗(yàn)的中藥組方中，生曬參、黃芪大補(bǔ)元?dú)狻V益五臟，針對氣虛的主要病機(jī)；三七、川芎、當(dāng)歸為臣，活血通絡(luò)、止血消瘀。諸藥相合，氣行則血行，血行則氣實(shí)，諸藥合用，標(biāo)本兼治，相得益彰，共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。

冠脈微血管結(jié)構(gòu)完整性與功能正常，是確保心肌收縮力儲備和局部功能恢復(fù)的先決條件，是心肌存活的必備條件，當(dāng)發(fā)生微小動脈和阻力血管的功能及結(jié)構(gòu)變化時(shí)，冠脈血流速率和血流儲備的變化可引起心肌缺血。低灌注梗死區(qū)和正常心肌之間的慢復(fù)流區(qū)域毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹、突出甚至脫落，受周邊的壞死組織壓迫，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)完整性受損，心肌毛細(xì)血管周細(xì)胞功能失調(diào)。血管壁在結(jié)構(gòu)上由血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞組成，它們分別構(gòu)成血管的內(nèi)外壁。周細(xì)胞又叫壁細(xì)胞，可以分化為巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，具有收縮能力，從而調(diào)節(jié)微循環(huán)的灌流量和通透性[9-10]。

有研究顯示，早期心肌缺血缺氧性壞死中周細(xì)胞數(shù)量在4 h后明顯增多，12 h后開始下降，48 h后顯著低于正常水平，推測周細(xì)胞作為心肌中的間質(zhì)細(xì)胞可能是心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的主要效應(yīng)細(xì)胞[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用益氣活血中藥后，毛細(xì)血管周細(xì)胞的計(jì)數(shù)減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益氣活血組較模型組心肌梗死邊緣區(qū)域MCD明顯增加，可見周細(xì)胞對毛細(xì)血管生長起到調(diào)控的作用。研究發(fā)現(xiàn)新生血管的生長和維持主要由周細(xì)胞的募集和分化所推動[12-13]。周細(xì)胞募集并伴隨發(fā)生基底膜重塑[14-15]?？梢?，周細(xì)胞的募集對血管新生是必不可少的。

此外，益氣活血中藥可提升內(nèi)皮分泌NO水平，并相應(yīng)降低ET-1水平。NO和ET-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一對作用相反的血管活性分子，NO的含量與生物活性的變化能夠反映內(nèi)皮功能的狀態(tài)。與益氣活血組模型組比較，ET-1下降，NO升高，說明益氣活血中藥具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用。

總之，益氣活血中藥可以通過降低心肌梗死大鼠毛細(xì)血管周細(xì)胞計(jì)數(shù)，維持血管的相對完整性，改善局部微循環(huán)的血流，減少梗死面積，并促進(jìn)血管新生，調(diào)節(jié)NO/ET-1的平衡，從而達(dá)到改善局部心肌血供的目的。

參考文獻(xiàn)：

[1] Skyschally A， Leineweber K， Gres P， et al. Cornary micro enbolization[J]. Basic Res Cardiol，2006，101（5）：373-382.

[2] 黃培培，郭書文，楊蟠儲，等.心肌缺血大鼠血清TNF-α、IL-6變化及益氣活血藥對其的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（9）：614-617.

[3] 張九峰.益氣活血藥對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及其調(diào)控分子的影響[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[4] 周劍宇.益氣活血藥防治大鼠心力衰竭心臟重塑的調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[5] 郭書文，崔巍，王碩仁，等.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡與增殖的時(shí)相特征及益氣活血藥對其影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（11）：1004-1007.

[6] 郭書文，王國華.益氣活血藥配合西醫(yī)治療冠心病心絞痛臨床研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（9）：12-13.

[7] 劉開宇，田海，孫露，等.標(biāo)準(zhǔn)化大鼠心肌梗死模型的制作[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41（6）：531-534.

[8] 易慧智，吳偉康，侯燦.中藥防治心肌缺血再灌注損傷的進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1995，15（8）：509-511.

[9] Kurz H， Fehr J， Nitschke R， Burkhardt H. Pericytes in the mature chorioallantoicmembrane capillary plexus contain desmin and alpha- smooth muscle actin：relevance for non-sprouting angiogenesis[J]. Histochemistry and Cell Biology，2008，130（5）：1027-1040.

[10] Oishi K， Kamiyashiki T， Ito Y. Isometric contraction of microvascular pericytes from mouse brain parenchyma[J]. Microvascular research，2007，73（1）：20-28.

[11] 李永梅，任立群，王心蕊.早期心肌缺血缺氧性壞死中周細(xì)胞數(shù)量的變化[J].心臟雜志，2009，21（2），211-214.

[12] Paquet-Fifield S， Schluter H， Li A， et al. A role for pericytes as micro environmental regulators of human skin tissue regeneration[J]. The Journal of clinical investigation，2009， 119（9）：2795-2806.

[13] Lin SL， Kisseleva T， Brenner DA， et al. Pericytes and perivascular fibroblasts are the primary source of collagen producing cells in obstructive fibrosis of the kidney[J]. The American Journal of Pathology，2008，173（6）：1617-1627.

篇5

隨著生活節(jié)奏加快，社會競爭日益激烈，越來越多的人們感受到社會生活更為緊張，由此引發(fā)的情緒與心理問題日益增多。憤怒是負(fù)性情緒的核心[1]，與健康和疾病的關(guān)系極為密切，有國外學(xué)者指出[2]，具有憤怒傾向的人群更易出現(xiàn)健康問題。中醫(yī)認(rèn)為，肝主疏泄，在志為怒，怒傷肝，長期或劇烈的憤怒情緒會阻礙肝疏泄氣機(jī)的功能，使氣機(jī)逆亂。頭為諸陽之會，五臟精華之血，六腑清陽之氣皆匯聚于腦，方有神明之用，若氣機(jī)逆亂，氣血不能正常輸布于腦，腦失濡養(yǎng)日久則可能導(dǎo)致腦老化加速。那么，憤怒情志對腦老化進(jìn)程究竟有何影響？其機(jī)制如何？本研究借助動物實(shí)驗(yàn)探討慢性憤怒應(yīng)激對大鼠腦老化進(jìn)程的影響及其部分神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 Wistar雄性大鼠56只，SPF級3月齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2006-0009），體重為360±10g。在河南省食品藥品檢驗(yàn)所動物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境設(shè)施動物實(shí)驗(yàn)室（SYXK（豫）2005-0011）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并由該實(shí)驗(yàn)室提供標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物滅菌飼料。正常飼養(yǎng)3日后，按體重隨機(jī)分為空白對照組、D-gal衰老及腦老化模型組（簡稱模型組）、慢性憤怒應(yīng)激組（簡稱憤怒應(yīng)激組）三組，每組14只，其余14只作為攻擊鼠。各組分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。（注：模型組予以注射D-gal，憤怒應(yīng)激組在注射D-gal基礎(chǔ)上引入憤怒刺激。）

1.2 主要試劑及儀器 大鼠血漿E酶免試劑盒（美國R&D公司，批號：09-05）；大鼠血漿NE酶免試劑盒（美國R&D公司，批號：09-05）；大鼠血漿DA酶免試劑盒（美國R&D公司，批號：09-05）；680自動酶標(biāo)分析儀（美國伯樂）；1575自動酶標(biāo)洗板機(jī)（美國伯樂）；HPS-250生化培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；Morris水迷宮（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 D-gal衰老模型 參考李文彬等[3] D-gal衰老及腦老化造模方法，模型組和憤怒應(yīng)激組注射D-gal溶液，制作衰老及腦老化模型。具體方法：將D-gal溶于生理鹽水，濃度為2%，注射容量為0.01ml？g-1，每日1次，頸后部皮下注射，空白對照組注射同體積生理鹽水，連續(xù)6周。每周測體重1次，依所測體重計(jì)算注射容量。

1.4 憤怒應(yīng)激組引入憤怒刺激的方法 課題組在夾尾間接激怒法[3]基礎(chǔ)上，受傳統(tǒng)直接電擊法的啟發(fā)，創(chuàng)立一種新型誘發(fā)大鼠憤怒情緒的方法――間接電擊激怒法。自實(shí)驗(yàn)第三周始每天下午3點(diǎn)對憤怒應(yīng)激組大鼠進(jìn)行憤怒刺激。具體方法：使用特制電刺激儀作為電刺激工具，把憤怒應(yīng)激組大鼠單獨(dú)放入特制金屬籠內(nèi)，再隨機(jī)放進(jìn)一只攻擊鼠，用一端電極觸碰攻擊鼠前部（電極的另一端與金屬籠相連以構(gòu)成回路），攻擊鼠受電擊被激惹，對憤怒應(yīng)激組大鼠發(fā)起攻擊，雙方互相撕咬、對峙，產(chǎn)生憤怒心理和行為。頻率為1～2次/min，每天刺激15min，連續(xù)4周。最后攻擊鼠丟棄不用。

1.5 標(biāo)本采集及制備 實(shí)驗(yàn)至第37天始，進(jìn)行Morris水迷宮測試，為期6天。至第42天完成實(shí)驗(yàn)后，禁食24小時(shí)，按每100g體重注射0.5～1.5ml 20%烏拉坦，麻醉后經(jīng)腹主動脈取血4～5ml，靜置、離心，吸取上清液，-70℃保存，用于測定血漿腎上腺素（epinephrine， E）、去甲腎上腺素（norepinephrine， NE）、多巴胺（dopamine， DA）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。數(shù)值變量以 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。數(shù)值變量組間均數(shù)差異的比較，正態(tài)分布和方差符合齊性

檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用LSD法，P

2 結(jié)果

2.1 慢性憤怒應(yīng)激對D-gal大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響表1顯示的是Morris水迷宮第6天的測試結(jié)果：憤怒應(yīng)激組較模型組大鼠尋臺時(shí)間（searching platform latency， SPL）明顯延長（P

2.2 慢性憤怒應(yīng)激對D-gal大鼠血漿兒茶酚胺的影響 與模型組相比，憤怒應(yīng)激組大鼠血漿E、NE、DA含量均明顯升高（P

3 討論

學(xué)習(xí)記憶能力減退是衰老尤其是腦老化的重要表現(xiàn)，臨床上腦老化患者可呈現(xiàn)進(jìn)行性精神狀態(tài)衰變，包括遠(yuǎn)近期記憶力障礙、情緒改變、分析判斷能力衰退、行為失常等。本研究用Morris水迷宮檢測動物空間定位與學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示：憤怒應(yīng)激組較模型組SPL明顯延長，提示持續(xù)的憤怒應(yīng)激加重D-gal衰老大鼠空間學(xué)習(xí)能力減退的程度，加速大鼠腦老化進(jìn)程。

E是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一種兒茶酚胺激素，在應(yīng)激狀態(tài)、內(nèi)臟神經(jīng)刺激和低血糖等情況下，釋放入血液循環(huán)，促進(jìn)糖原分解并升高血糖，促進(jìn)脂肪分解，引起心跳加快。當(dāng)人體經(jīng)歷某些刺激（如興奮，恐懼，緊張等）時(shí)，分泌E，促使呼吸加快以提供大量氧氣，同時(shí)引起心跳與血液流動加速，瞳孔放大，為身體活動提供更多能量，使反應(yīng)更加快速。

NE屬于神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種激素，循環(huán)血液中的NE主要來自腎上腺髓質(zhì)。目前認(rèn)為中樞的NE神經(jīng)元與交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)是兩個獨(dú)立的系統(tǒng)，但在情緒活動加劇時(shí)，兩者的活動都增強(qiáng)。NE系統(tǒng)適度興奮可能產(chǎn)生興奮和欣快的情緒，過度興奮則可能導(dǎo)致躁狂和攻擊行為，說明NE水平變化與情緒變化密切相關(guān)。血中E、NE水平，目前被公認(rèn)為反映交感-腎上腺髓質(zhì)功能狀態(tài)的可靠指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：接受憤怒刺激的憤怒應(yīng)激組大鼠血漿E、NE含量明顯上升，可能是由于憤怒激活了交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)，導(dǎo)致大量的E、NE釋放入血。

DA由腦內(nèi)分泌，屬于兒茶酚胺類，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的覺醒、注意力和精神情緒狀態(tài)。中樞內(nèi)多巴胺系統(tǒng)主要參與對軀體運(yùn)動、精神情緒活動、垂體內(nèi)分泌功能以及心血管活動等的調(diào)節(jié)。在應(yīng)激情況下，DA神經(jīng)元生理活動加強(qiáng)，當(dāng)應(yīng)激的強(qiáng)度或持續(xù)時(shí)間超過機(jī)體耐受能力時(shí)，將導(dǎo)致認(rèn)知功能及操作能力下降。酪氨酸的充足供應(yīng)能增強(qiáng)DA的合成和釋放，在一定程度上拮抗應(yīng)激對中樞DA神經(jīng)元的損害[4]。本研究中，模型組DA較空白對照組含量有下降趨勢，提示衰老有阻礙DA合成，降低認(rèn)知能力的傾向；憤怒應(yīng)激組DA含量較模型組明顯升高，提示憤怒情緒可引起血中DA含量增加。

三種兒茶酚胺E、NE、DA均可興奮HPA軸功能，導(dǎo)致HPA軸亢進(jìn)，進(jìn)而引起血中促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic hormone， ACTH）、糖皮質(zhì)激素（cortisol， CORT）濃度上升。海馬上糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor， GR）表達(dá)最高，血中高濃度的CORT極易與GR結(jié)合，引起GR損傷，進(jìn)而導(dǎo)致海馬組織受損[5-6]。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，海馬損傷必將使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，加速腦老化進(jìn)程。本研究中，長期憤怒應(yīng)激使大鼠血漿E、NE、DA含量上升，且SPL明顯延長，表明血漿兒茶酚胺水平升高，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，提示出現(xiàn)腦老化跡象。因此可以認(rèn)為，憤怒情緒長期積累引起血漿兒茶酚胺含量升高，從而進(jìn)一步激活HPA軸，亢進(jìn)的HPA軸分泌大量CORT，損傷海馬組織而加速腦老化進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)

[1] 詹向紅，劉勝利，江虹等. 憤怒情志表達(dá)方式及特質(zhì)對自主神經(jīng)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志.2011，26（7）：1475-1478.

[2] Williams JE， Johnson AM， Heiss G， et al. Association between exposure to combat-related stress and psychological health in aging men： the Atherosclerosis Risk in Communities （ARIC） Study[J]. J Trauma Stress. 2010，23（3）：358-366.

篇6

Depressive effect on proliferation of vascular smooth muscle cells by tetrandrine in hypertensive rats

LI Qing-Ping（Department of Cardiovascular Pharmacology， Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China）

LU Ze-An（Department of Cardiovascular Pharmacology， Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China）

篇7

中圖分類號：G64文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1003-949X(2008)-12-0077-02

“求美”是大學(xué)教育的重要功能。文化、藝術(shù)的教育是培養(yǎng)高品位、高素質(zhì)人才的必要內(nèi)容。只有學(xué)會欣賞美，才能創(chuàng)造美。先生在北大初建時(shí)期就十分重視在大學(xué)教育中提倡“求美”，他主張“美育與智育相輔而成，知識以外兼美感情，以圖德育之完成?！被顒咏逃鳛閷W(xué)生自由發(fā)展的載體、經(jīng)驗(yàn)積累的途徑能夠提升學(xué)校文化、豐富學(xué)校生活、增強(qiáng)學(xué)?；盍Γ瑸閷W(xué)生的自由全面發(fā)展提供平臺。

一、“求美”文化藝術(shù)活動教育的概念

“求美”文化藝術(shù)活動教育是指通過體驗(yàn)、養(yǎng)成、熏陶，使人文藝術(shù)知識內(nèi)化為大學(xué)生的人文精神和藝術(shù)素養(yǎng)的教育過程?！扒竺馈蔽幕囆g(shù)活動教育旨在培養(yǎng)學(xué)生人文精神、審美能力和“求美”品格。“求美”文化藝術(shù)活動教育堅(jiān)持為人民服務(wù)、為社會主義服務(wù)，堅(jiān)持百家爭鳴、百花齊放，堅(jiān)持面向現(xiàn)代化、面向世界、面向未來的原則，對文化藝術(shù)活動教育內(nèi)容進(jìn)行了有針對性、有選擇的取舍，努力做到雅俗共賞、健康向上。

“求美”文化藝術(shù)活動是大學(xué)校園文化的核心內(nèi)容。大學(xué)校園文化歷來被看作社會文化發(fā)展的潮頭和先導(dǎo)，它相對于一般社會文化具有先進(jìn)性和超前性，對社會文化發(fā)展負(fù)有選擇與創(chuàng)造的責(zé)任。如今，隨著校園對外開放的程度日益擴(kuò)大，社會上的各種文化觀念、行為準(zhǔn)則、生產(chǎn)方式也開始躋身校園。多元娛樂活動和生活方式的出現(xiàn)，對學(xué)術(shù)、理性、審美等具有品味的校園文化沖擊極大。高校面臨著用高雅健康的文化藝術(shù)活動占領(lǐng)校園文化陣地，用積極向上的內(nèi)容和形式陶冶大學(xué)生思想情操的考驗(yàn)。

二、“求美”文化藝術(shù)活動教育的意義

1.文化藝術(shù)活動教育有利于大學(xué)生知識結(jié)構(gòu)的完善

新時(shí)期，社會需要高等學(xué)校教育培養(yǎng)出集科學(xué)素養(yǎng)、人文素養(yǎng)、藝術(shù)素養(yǎng)于一身的高素質(zhì)人才。過去，高校普遍重視為大學(xué)生提供專業(yè)教育，對其他的領(lǐng)域有所淡化或忽視，致使大學(xué)生在知識結(jié)構(gòu)的構(gòu)成上，更多的是專業(yè)性和專門化的知識體系，其思考和認(rèn)識的視野比較狹窄。專業(yè)知識的教育只形成了大學(xué)生知識結(jié)構(gòu)的一個部分，要形成完善的知識結(jié)構(gòu)就必須有相對的輔助知識作為支撐。“求美”文化藝術(shù)活動教育能有效的促進(jìn)科學(xué)與人文的交融，通過科學(xué)與人文“兩種文化”間的深刻對話，使他們在獲得知識的基礎(chǔ)上，形成深厚的文化底蘊(yùn)，達(dá)到溝通、整合的目的，使大學(xué)生的理性與情感，科學(xué)精神與人文素養(yǎng)得到和諧發(fā)展，從而完善大學(xué)生的知識結(jié)構(gòu)。

2.文化藝術(shù)活動有利于大學(xué)生社會性的培養(yǎng)

人的社會性是人在社會中生存和發(fā)展的基礎(chǔ)和前提。人的社會性是指人在社會化的過程中具有了人類所特有的合作、理解、同情、關(guān)愛等主體意識，人具有了個體完整性。如果人缺乏了社會性，不僅僅是難以融入社會，而且容易產(chǎn)生遠(yuǎn)離社會的意識，一旦個體產(chǎn)生遠(yuǎn)離社會的意識，的偏激和偏見就可能滋生，不僅不利于社會的健康發(fā)展，而且也會影響人的健康發(fā)展?！扒竺馈蔽幕囆g(shù)活動，倡導(dǎo)提升大學(xué)生的人文素養(yǎng)、培養(yǎng)大學(xué)生的公民意識、形成大學(xué)生的社會責(zé)任感，通過人文、社會、科學(xué)知識、能力和修養(yǎng)的教育，培養(yǎng)大學(xué)生的合作精神、團(tuán)隊(duì)意識、集體主義、人文關(guān)懷等主體意識，使大學(xué)生認(rèn)識到人的社會性對于人、社會、世界發(fā)展的意義和價(jià)值，使大學(xué)生在人與人、人與社會的沖突與融合中，學(xué)會克服缺陷，充分理解他人和社會，減少片面的看法，提升大學(xué)生的社會性。

3.文化藝術(shù)活動教育有利于大學(xué)生倫理道德的形成

“求美”文化藝術(shù)活動教育是著重于精神領(lǐng)域的教育，它以文化藝術(shù)的形式，富有形象性、感染性的特點(diǎn)，使人們在潛移默化的影響下，激起情感共鳴，從而使社會道德要求和善惡觀念逐漸形成。文化藝術(shù)活動能展現(xiàn)美好的生活圖景，深刻地反映社會生活，給人們提供區(qū)別善惡、美丑的標(biāo)準(zhǔn)，引起內(nèi)心共鳴，使人們受到深刻的思想教育。長期以來，由于高等教育過分注重專業(yè)教育，使得大學(xué)生在思考人、社會、自然之間的關(guān)系方面，缺乏倫理道德觀念。當(dāng)今，世界性的生態(tài)保護(hù)與地球的永恒發(fā)展問題、國際化與本土文化的問題、生物科技與社會倫理問題、國際政治與民族沖突、種族沖突與宗教倫理等等，都成為當(dāng)今世界人們必須思考的問題。因此，通過文化藝術(shù)活動，可以培養(yǎng)大學(xué)生的人文精神，提升大學(xué)生的文化品格，使他們尊重人的價(jià)值，獲得超越人的生存的精神內(nèi)涵，以其自主性、社會性思考人與社會、自然之間的關(guān)系處理，并以倫理學(xué)的視角思考科技發(fā)展與人、社會、自然之間的生態(tài)倫理關(guān)系，有利于培育形成大學(xué)生的倫理道德觀念。

4.文化藝術(shù)活動教育有利于大學(xué)生審美情趣的培育

對美的不同觀點(diǎn)，不僅是個體對美的評判標(biāo)準(zhǔn)，也集中體現(xiàn)出個體對美的感受、認(rèn)知、理解和欣賞的素養(yǎng)，展示出個體在生活中的審美情趣。因此，對大學(xué)生的審美情趣的培育，不僅關(guān)系著大學(xué)生以何種標(biāo)準(zhǔn)去評判、感受、認(rèn)知、理解和欣賞美，而且關(guān)系著大學(xué)生以怎樣的審美情趣在生活中創(chuàng)造美。學(xué)會以高尚的審美情趣感受美、理解美、欣賞美、創(chuàng)造美，既是完善人生發(fā)展的一個重要方面，又是營造和創(chuàng)建現(xiàn)實(shí)生活及追求未來生活的內(nèi)在機(jī)制和動力。大學(xué)生已進(jìn)入青年階段，不僅關(guān)注自己和他人的儀表美、語言美、行為美，而且以更為細(xì)膩的情感和獨(dú)立的思考來感受、認(rèn)知、評鑒生活中各種人和事物的更廣泛、更深刻的美，并以美的標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)造美。所以，通過文化藝術(shù)活動教育，可以提高大學(xué)生的審美情趣，讓大學(xué)生對美好事物的感受、理解和創(chuàng)造從簡單的、表面的印象提升為對豐富、深刻的美好意境的欣賞，升華到精神美的境界，激發(fā)大學(xué)生理解美、欣賞美和創(chuàng)造美的意識和激情。

三、“求美”文化藝術(shù)活動教育內(nèi)容確定的原則

“求美”文化藝術(shù)活動教育的內(nèi)容體系是大學(xué)生文化藝術(shù)素質(zhì)教育的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，是實(shí)現(xiàn)教育目標(biāo)的重要保證，是大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育有效實(shí)施的根本條件。其教育內(nèi)容的確定既要符合素質(zhì)教育的目的又要滿足學(xué)生的需求，既要區(qū)別專業(yè)教育、學(xué)科教育又要與專業(yè)教育、學(xué)科教育相銜接，因此要科學(xué)、合理的進(jìn)行選擇、整合、優(yōu)化，這就必須遵循一定的客觀原則。

1.導(dǎo)向性原則

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、分工的細(xì)化、文明的進(jìn)步，現(xiàn)代社會將越來越重視人才的綜合品性，特別是人才的團(tuán)結(jié)合作意識、人文素養(yǎng)、心智模式。因此，構(gòu)建“求美”文化藝術(shù)活動教育內(nèi)容體系，應(yīng)該關(guān)注大學(xué)生品德、團(tuán)隊(duì)意識、創(chuàng)新精神、人文修養(yǎng)等特性的培育。讓大學(xué)生獲得一個合格建設(shè)者所應(yīng)該具備的公民意識、社會責(zé)任意識，讓社會逐步理解大學(xué)生這些素質(zhì)的提升對于社會發(fā)展的意義和價(jià)值。

2.基礎(chǔ)性原則

大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育不是專業(yè)教育的附屬，它主要是為大學(xué)生的全面發(fā)展提供通識性、廣博性的基礎(chǔ)性知識和能力。大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育不是對學(xué)生進(jìn)行專業(yè)知識和專業(yè)能力的教育，而是主要進(jìn)行基本認(rèn)識、基本素養(yǎng)、基本技能的訓(xùn)練，是從大學(xué)生全面發(fā)展的角度構(gòu)建內(nèi)容體系。通常我們將人的進(jìn)一步發(fā)展的基礎(chǔ)歸納為三個方面，即知識、能力、修養(yǎng)。所謂“知識”，不僅是指專業(yè)知識，還包括人文歷史、文明道德、科學(xué)技術(shù)、社會藝術(shù)等一般性的知識；所謂“能力”，也不僅僅是指專業(yè)的技能技巧，還包括思維理解能力、實(shí)踐操作能力、自主學(xué)習(xí)能力等等；而“修養(yǎng)”更是一個人發(fā)展的基石，表現(xiàn)為健康的個性心理品質(zhì)、積極的團(tuán)隊(duì)合作意識、文明的社會道德行為、良好的科學(xué)素養(yǎng)等。

3.民族性原則

在大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育內(nèi)容選擇的過程中，不僅要重視學(xué)生基礎(chǔ)性知識和能力的培養(yǎng)，還應(yīng)特別重視中國傳統(tǒng)文化的特色，要求大學(xué)生熟悉中國文化的精髓，知曉中國文化的歷史淵源。這一原則的提出主要是針對我國高校大學(xué)生缺乏對我國傳統(tǒng)文化全面的認(rèn)識和理解，特別是我國傳統(tǒng)文化中的人文教育思想，儒家的“仁”、“孝”、“信”的理念，對待人生和社會的積極態(tài)度等思想學(xué)說，這些內(nèi)容對當(dāng)代大學(xué)生可能比較陌生。所以，堅(jiān)持民族性原則，合理安排教育內(nèi)容，加強(qiáng)對我國民族文化及思想方面的教育，不僅有利于大學(xué)生認(rèn)識和理解我國民族文化的博大精深，而且能夠培養(yǎng)大學(xué)生的民族精神。

4.計(jì)劃性原則

大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育內(nèi)容體系構(gòu)建如果不合理，就容易造成與專業(yè)教育和學(xué)科課程內(nèi)容的交叉，從而沖擊專業(yè)教育。要實(shí)現(xiàn)把大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育內(nèi)容融入學(xué)校整體教育內(nèi)容體系，既達(dá)成素質(zhì)教育的目標(biāo)，又不至于沖擊專業(yè)教育。因此，必須有目的、有計(jì)劃地對內(nèi)容體系進(jìn)行精心、合理的設(shè)計(jì)，避免教育內(nèi)容的重疊，使大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育內(nèi)容體系盡量系統(tǒng)化、簡潔化。

5.整合性原則

大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育的內(nèi)容不是相對獨(dú)立的體系和結(jié)構(gòu)，而是眾多相關(guān)學(xué)科基礎(chǔ)文化知識、技術(shù)能力經(jīng)驗(yàn)的綜合，各個方面密切相關(guān)、相互作用、相互制約，共同構(gòu)成一個開放的適合學(xué)生各方面需要的內(nèi)容整體。在內(nèi)容選擇上不是“雜、亂、散”碎片內(nèi)容的堆砌，而應(yīng)遵循教育規(guī)律，遵循大學(xué)生發(fā)展的需求，圍繞人的綜合素質(zhì)的提高，整合大學(xué)生的校園生活和社會生活，并將知識性學(xué)習(xí)和體驗(yàn)養(yǎng)成性的教育有機(jī)的結(jié)合起來，做到由淺入深、重點(diǎn)突出、整體協(xié)調(diào)，從而提升學(xué)生的主體意識，學(xué)會處理人與人、人與社會之間的關(guān)系，充分理解他人和社會，培育大學(xué)生的社會責(zé)任感，倡導(dǎo)集體主義、人文關(guān)懷等時(shí)代精神。

6.體驗(yàn)與養(yǎng)成性原則

大學(xué)生“求美”文化藝術(shù)活動教育不同于其他教育，不能單靠知識傳授和技能培養(yǎng)來完成，而是要通過教育、體驗(yàn)、養(yǎng)成、熏陶，從而促使大學(xué)生把學(xué)到的知識和能力內(nèi)化為自身的素質(zhì)和修養(yǎng)，塑造他們的科學(xué)與人文精神。這就需要在內(nèi)容的構(gòu)建上強(qiáng)化體驗(yàn)性和養(yǎng)成性教育，把體驗(yàn)性、養(yǎng)成性的活動和方法作為教育內(nèi)容，通過規(guī)范的引導(dǎo)、環(huán)境的熏陶、身體力行的實(shí)踐，幫助大學(xué)生形成文明的舉止和良好的人格。

四、“求美”文化藝術(shù)活動教育的內(nèi)容

1.哲學(xué)知識普及活動

根據(jù)的觀點(diǎn)，“任何真正的哲學(xué)都是自己時(shí)代精神的精華”。對青年大學(xué)生進(jìn)行哲學(xué)教育，增強(qiáng)其理論思辨能力，有助于他們高屋建瓴，把握整體，突破各具體學(xué)科的局限，超越人文與科學(xué)認(rèn)識的界限。把哲學(xué)教育作為“求美”文化藝術(shù)活動教育的主要內(nèi)容，有助于引導(dǎo)學(xué)生通過哲學(xué)思辨，去探究超越于現(xiàn)實(shí)功利的人生意義、理想、信仰與終極關(guān)懷，構(gòu)建正確的世界觀、人生觀和價(jià)值體系。開設(shè)定期的論壇、講座是進(jìn)行哲學(xué)知識普及的最好形式。

2.傳統(tǒng)文化教育活動

我國的傳統(tǒng)文化是在中國社會長期發(fā)展過程中逐漸形成并支配著大多數(shù)人的具有積極意義的價(jià)值觀念、道德標(biāo)準(zhǔn)和行為規(guī)范等意識形態(tài)因素，是一個蘊(yùn)含著豐富內(nèi)容的綜合體。所以，加強(qiáng)對我國文化及思想方面的知識教育，不僅有利于大學(xué)生認(rèn)識和理解我國傳統(tǒng)文化的博大精深，而且能讓學(xué)生重塑民族人文精神，樹立奮進(jìn)圖強(qiáng)的民族精神，激發(fā)學(xué)生的愛國主義情感與高度的民族責(zé)任感。如開展詩詞吟誦大賽、誦讀經(jīng)典活動、傳統(tǒng)紀(jì)念日的紀(jì)念活動、典型歷史人物的學(xué)習(xí)活動等。

3.世界文化教育活動

隨著我國改革開放的不斷深入，西方多元文化的價(jià)值觀、不同主張的自由化思想觀念等對我國高校大學(xué)生的沖擊很大，極大地影響著大學(xué)生對我國傳統(tǒng)文化和社會發(fā)展的立場和態(tài)度。通過對世界文化的教育，使大學(xué)生對世界文化及思想有個系統(tǒng)、全面的認(rèn)識，可以讓學(xué)生了解和認(rèn)識世界各國人民的歷史，掌握歷史發(fā)展的脈搏，讓學(xué)生在錯綜復(fù)雜的國際關(guān)系中保持清醒的頭腦?？梢蚤_設(shè)國際文化交流論壇，邀請專家進(jìn)行國際文化講座，進(jìn)行國際文化交流，開展西方經(jīng)典電影、戲劇、文學(xué)賞析活動等。

4.人與自然、社會和諧共處教育活動

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人與自然之間的關(guān)系出現(xiàn)了改變，人類的活動影響了自然的自我發(fā)展,并嚴(yán)重危及了人類自身的生存和發(fā)展。因此，應(yīng)該讓大學(xué)生了解人與自然和諧共處的意義和價(jià)值，思考人類社會可持續(xù)發(fā)展的問題，加強(qiáng)大學(xué)生的環(huán)境意識。另外，讓大學(xué)生確立起“人”是社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的最終目的這一思想觀念，使大學(xué)生學(xué)會與人相處、與人交流，從而實(shí)現(xiàn)人與社會的和諧發(fā)展?？梢酝ㄟ^開展“保護(hù)母親河”主題活動、第三只眼看社會主題攝影展、“人與自然”主題征文等活動進(jìn)行這一內(nèi)容的教育。

5.文藝鑒賞教育活動

文學(xué)、藝術(shù)作品包含著人們對不同時(shí)期人的生存狀況的描寫和反映，同時(shí)也體現(xiàn)著人們對人生問題的深刻思考，不僅能引發(fā)大學(xué)生的思考，而且能夠升華大學(xué)生的人文關(guān)懷、潤澤大學(xué)生的心靈、促進(jìn)大學(xué)生人的本性的覺醒和提升。通過引導(dǎo)大學(xué)生進(jìn)行文藝作品鑒賞，能夠讓他們領(lǐng)悟美的真諦，培養(yǎng)大學(xué)生欣賞美、體驗(yàn)美、鑒賞美和創(chuàng)造美的意識，進(jìn)一步提高大學(xué)生的藝術(shù)修養(yǎng)和審美能力，使他們對文學(xué)、藝術(shù)作品有一定的的鑒賞和評論能力，能借助文學(xué)、美術(shù)、音樂來表達(dá)自己的感情，能將追求完美的意識滲透到生活和學(xué)習(xí)中去，升華大學(xué)生對生活美、藝術(shù)美的追求，培養(yǎng)其高雅的審美情趣?？梢酝ㄟ^戲劇、歌舞、器樂、文學(xué)、傳統(tǒng)藝術(shù)表演等各種形式培養(yǎng)大學(xué)生的審美能力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 茍克鼎.課余活動在大學(xué)生素質(zhì)培養(yǎng)中的地位和作用[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào),2000(2)

篇8

研究表明CXC趨化因子配體16(CXC chemokine ligand 16，CXCL16)作為一種新的趨化因子配體，能夠促進(jìn)動脈平滑肌的增殖〔1〕。羅格列酮(RSG)作為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的激動劑抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖〔2〕。本研究通過觀察RSG對CXCL16誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，驗(yàn)證其在血管平滑肌增殖中的作用，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年大鼠，雌雄不限(由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，重組鼠CXCL16(美國R&D systems公司)，LY294002(美國BioVision公司)，吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)(美國Sigma公司)，兔抗大鼠α平滑肌肌動蛋白(αSMA)多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)，兔抗大鼠CXCL16多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。RTPCR試劑盒(立陶宛MBI Fermentas公司)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠髂主動脈平滑肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 經(jīng)水合氯醛麻醉后，頸動脈放血處死動物。在無菌操作條件下迅速取出全部髂段主動脈，立即置于冷DHank′s液中，用眼科鑷仔細(xì)剝離近外膜側(cè)1/3處含成纖維細(xì)胞多的外膜后，放在無菌的玻璃紙上固定后，縱形剖開血管，用鋒利刀片輕輕刮除多余脂肪及內(nèi)膜，DHank′s液洗滌，放入培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，將小組織塊均勻鋪于培養(yǎng)瓶壁，置于CO2孵箱。待組織塊貼壁牢固后，再加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 平滑肌細(xì)胞的傳代及鑒定 待細(xì)胞生長至瓶底的80%以上后，吸棄培養(yǎng)液，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)充分清洗3次。加入0.25%胰蛋白酶少許，室溫下將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察。待細(xì)胞回縮、細(xì)胞間隙增大后，立即用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，吸除消化液，加PBS液，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，除去殘余消化液。加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落瓶壁形成細(xì)胞懸液，分裝后繼續(xù)培養(yǎng)。取其4～6代細(xì)胞用兔抗大鼠αSMA多克隆抗體對其進(jìn)行鑒定。

1.2.3 用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測CXCL16對平滑肌細(xì)胞增殖的影響 以1×104/ml個細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，用濃度為50 ng/ml的CXCL16分別作用于平滑肌細(xì)胞1、2、4及8 d，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定平滑肌細(xì)胞的增殖情況。僅含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為陰性對照;含20 ng/ml血小板生長因子(PDGF)BB的上述培養(yǎng)液作為陽性對照。

1.2.4 藥物處理 取1.2.2傳代細(xì)胞，分為5組，用不同藥物進(jìn)行處理?？瞻讓φ战M(1組)：RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)細(xì)胞。CXCL16組：在1組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入終濃度為50 ng/ml CXCL16。PI3K/Akt特異性抑制劑組(CXCL16+LY294002)：在1組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入終濃度為20 μmol/L LY294002，作用1 h后，再加入終濃度為50 ng/ml CXCL16。核轉(zhuǎn)錄因子(NFκB)特異性抑制劑組(CXCL16+PDTC)：在1組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入終濃度為100 μmol/L PDTC，作用1 h后，再加入終濃度為50 ng/ml CXCL16。RSG組(CXCL16+RSG)：在1組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入終濃度為20 μmol/L RSG，作用1 h后，再加入終濃度為50 ng/ml CXCL16。每組至少重復(fù)3次。

1.2.5 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測血管平滑肌細(xì)胞的增殖 將細(xì)胞消化后，制備單細(xì)胞懸液。以1×104個/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去上清，加入條件培養(yǎng)基150 μl，每組設(shè)8個復(fù)孔。培養(yǎng)4 d后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μl MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO終止反應(yīng)。振蕩混勻，置酶標(biāo)儀上測定490 nm處的吸光度(A490)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件，所有數(shù)據(jù)以x±s表示。組間比較采用方差分析或秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血管平滑肌細(xì)胞的鑒定 倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈長梭形生長，在細(xì)胞生長融合部分可見明顯的“峰谷”形態(tài)。用平滑肌細(xì)胞特異性抗體αSMA進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，光鏡下觀察可見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞。見圖1。

圖1 大鼠平滑肌細(xì)胞免疫組化鑒定(DAB，×400)

2.2 CXCL16對平滑肌細(xì)胞增殖的影響 自CXCL16作用的第1天起，CXCL16組平滑肌細(xì)胞增殖能力明顯高于陰性對照組(P

2.3 RSG抑制平滑肌細(xì)胞的增殖 以50 ng/ml CXCL16作用于平滑肌細(xì)胞4 d后，采用MTT法測定細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，CXCL16組平滑肌細(xì)胞增殖能力較對照組明顯提高(P

3 討 論

人們發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化(AS)不只是簡單的脂質(zhì)堆積，炎癥在其發(fā)生、發(fā)展以及最終斑塊破裂的整個病理過程中顯示出至關(guān)重要的作用〔3〕。因此，許多細(xì)胞因子引起了人們的關(guān)注，CXCL16是一種新發(fā)現(xiàn)的趨化因子配體。已發(fā)現(xiàn)CXCL16可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖，還能增加細(xì)胞與細(xì)胞的黏附，也有研究發(fā)現(xiàn)AS斑塊處巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞CXCL16表達(dá)增高，因此可推斷CXCL16在多個環(huán)節(jié)參與AS的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)也提示它可能在損傷修復(fù)以及炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。本研究以離體血管平滑肌細(xì)胞為原料，發(fā)現(xiàn)CXCL16組平滑肌細(xì)胞增殖能力明顯高于陰性對照組，這種促進(jìn)作用的峰值出現(xiàn)在第4天，此結(jié)果驗(yàn)證了它對血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用，同時(shí)也證實(shí)盡管炎癥反應(yīng)在上調(diào)CXCL16表達(dá)中起著重要的作用，但最終這些炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞增殖可能還是由CXCL16及其受體來實(shí)現(xiàn)的。這就為糾正CXCL16表達(dá)，進(jìn)而治療AS等損傷修復(fù)型疾病提供了一種新的可能。

RSG除了作為胰島素的增效劑在臨床上廣泛應(yīng)用外，近年也有很多用它治療AS等其他疾病的嘗試〔4～6〕。RSG可提高內(nèi)皮系統(tǒng)對各種損傷的修復(fù)能力，也提示了胰島素增敏劑對血管內(nèi)皮細(xì)胞很好的保護(hù)作用，對維持血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能至關(guān)重要〔7〕。本研究通過MTT法驗(yàn)證RSG對CXCL16誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。RSG等噻唑烷二酮類藥物改善血管內(nèi)皮功能、抗AS的機(jī)制尚未徹底清楚可能為：① 通過增加胰島素的敏感性，增加eNOS的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，抑制ET1的釋放等間接的因素而改善內(nèi)皮功能〔8〕;②最近發(fā)現(xiàn)PPARγ也存在于AS發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞如血管平滑肌細(xì)胞、巨噬泡沫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，提示噻唑烷二酮類藥物可直接作用于PPARγ影響AS的進(jìn)程〔9〕;③ 抑制炎性介質(zhì)釋放，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，減輕AS發(fā)展過程〔10〕。同時(shí)，發(fā)揮降糖、降脂作用，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，從改善代謝方面發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)為RSG抗血管平滑肌增殖提供依據(jù)，同時(shí)也為開發(fā)羅格列酮臨床上新的使用途徑提供了理論基礎(chǔ)，噻唑烷二酮類藥物抗AS的具體機(jī)制還需更進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

1 周珊珊，鄭 楊.CXCL16與動脈粥樣硬化〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2006;25(6):4669.

2 Wakino S，Kintscher U，Kim S，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma ligands inhibit retinoblastoma phosphorylation and G1> S transition in vascular smooth muscle cells〔J〕.J Biol Chem，2000;275(19):2243541.

3 Libby P，Ridker PM，Maseri A.Inflammation and atherosclerosis〔J〕. Circulation，2002;105(9)：13543.

4 王朝暉，羅 豐，劉小楣.PPARγ激活劑羅格列酮對兔動脈粥樣硬化斑塊消退的影響〔J〕.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005;40(11):10513.

5 姚 園，江 洪，徐 超，等.羅格列酮對大鼠胸主動脈球囊損傷后內(nèi)皮再生和內(nèi)膜增生的影響〔J〕.中國介入心臟病學(xué)雜志，2006;14(1)：4850.

6 賈國洪，李紹冰，王春梅，等.大鼠胸主動脈損傷后羅格列酮對血管再狹窄及基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響〔J〕.臨床心血管病雜志，2006;22(4):2313.

7 Artwohl M.Thiazolidinediones inhibit apoptosis and heat shock protein 60 expression in human vascular endothelial cells〔J〕.Thromb Haemost，2005;93(5)：8105.

篇9

關(guān)鍵詞: 反義寡核苷酸;血管平滑肌細(xì)胞;再狹窄;血小板衍化生長因子;受體;細(xì)胞核增殖抗原

摘 要:目的 研究血小板衍化生長因子β受體（PDGFR-β）反義寡核苷酸（AODN）對血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖的影響. 方法 建立大鼠血管平滑肌細(xì)胞體外增殖模型.將細(xì)胞分為反義寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、無義寡核苷酸組和空白對照組，其中反義組按濃度又分為1，2.5，5，10和15μmol L-1 5小組.在加藥后24，48和72h以流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析細(xì)胞核增殖抗原的表達(dá)，MTT（四唑鹽）比色法測定細(xì)胞增殖活力. 結(jié)果 10μmol L-1 PDGFR-βAODN干預(yù)VSMC48h后，處于DNA合成前期（G0 /G1 ）細(xì)胞數(shù)分?jǐn)?shù)（0.70）高于空白對照組（0.07，P

Keywords:antisense oligonucleotide;vascular smooth muscle cell;restenosis;platelet derived growth factor;receptor;proliferating cell nuclear antigen

Abstract:AIM To study the effect of PDGFR-βAODN on proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells（VSMC）.METHODS Cultured rat aortic VSMC mod-el was established in vitro.The cells were pided into antis-ese oligonucleotide（AODN）group，sense oligonucleotide（SODN）group，scrambled oligonucleotide（CODN）group and control group.The cells in AODN group were subpided into five small groups by concentration of1，2.5，5，10，15μmol L-1 .MTT assay，flow cytometry，immunohis-tochemistry for proliferating cell nuclear antigene（PCNA）were used to determine the effects of PDGFR-βAODN on proliferation of VSMC.RESULTS The percentage of quies-cent cells（G0 /G1 ）of AODN group at48h（0.70）were much higher than that of control group（0.07），P

0 引言

經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）和冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）是治療冠心病的有效手段，但30%～50%術(shù)后再狹窄嚴(yán)重影響手術(shù)療效［1，2］ .研究證明再狹窄的實(shí)質(zhì)就是血管中層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移和增生

［3］ .血小板衍化生長因子及其β受體（PDGFR-β）在血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的遷移增生過程中起重要作用

［4］ .我們擬探討在大鼠體外VSMC增殖模型中，PDGFR-β反義寡核苷酸（AODN）對VSMC增殖的影響.

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠清潔級，4wk齡，雌雄不限，體質(zhì)量（250±20）g，4～8wk齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;抗大鼠PCNA mAb、混合膠原酶、胰蛋白酶、MTT購于Sigma公司;96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板購于Costar公司;PDGFR-βAODN鏈（18bp）5’TAT CAC TCC TGG AAG CCC3’，正義寡核苷酸鏈（SODN）5’GGG CTT CCA GGA GTG ATA3’，無關(guān)寡核苷酸鏈（CODN）5’GTG ATA GTA TGC CGA GCA3’，由加拿大上海Sagon公司合成并進(jìn)行全硫代磷酸化修飾和電泳鑒定;SABC試劑盒購于武漢博士德生物工程公司;胎牛血清購于浙江金華犢牛研究所;流式細(xì)胞儀（EFICS ELITE法國）;酶聯(lián)免疫檢測儀（DG5031，華東電子儀器廠）;SD大鼠頸椎脫臼法處死后，采用膠原酶法分離取得VSMC進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，經(jīng)α-SMactin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定確為VSMC、純度>95%，采用5～10代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象.

1.2 方法

1.2.1 VSMC細(xì)胞增殖活力的測定 取生長融合期細(xì)胞制成1×104 L-1 密度的單細(xì)胞懸液接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁伸展后，無血清DMEM培養(yǎng)液馴化24h.采取不同的加藥方案:①單加不同濃度的反義寡核苷酸;②加入5.0μmol L-1 反義、正義、無義寡核苷酸;③空白組加等量培養(yǎng)液，設(shè)調(diào)零孔.每24h各取8孔，每孔內(nèi)加入MTT20μL，37℃繼續(xù)孵育4h后小心吸去培養(yǎng)液.每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，震蕩器震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀（波長490nm）測定各孔的吸光度值［5］ .細(xì)胞增殖抑制百分率=（1-試驗(yàn)組A值）/對照組A值均數(shù)×100%.

1.2.2 PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將5×105 L-1 密度細(xì)胞懸液，接種于已置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁伸展后，無血清DMEM培養(yǎng)液馴化24h后，加入含不同干預(yù)因素（同1.2.1）的200mL L-1 胎牛血清DMEM，每24h各取5孔，取出蓋玻片，按SABC試劑盒說明進(jìn)行其余步驟操作，最后DAB顯色，常規(guī)系列脫水、透明.鏡下觀察.PCNA染色陽性標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒.隨機(jī)計(jì)數(shù)5張蓋玻片中5個以上高倍鏡視野500個細(xì)胞，計(jì)算平均每100個細(xì)胞中陽性百分率，根據(jù)染色強(qiáng)度和范圍分為:陰性（-）:陽性細(xì)胞50%.

1.2.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期 將細(xì)胞制成2×105 L-1 密度的單細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)瓶，48h后棄去 培養(yǎng)液，無血清馴化24h，細(xì)胞周期同步化后，分別加入5.0μmol L-1 反義、無義寡核苷酸，繼續(xù)培養(yǎng)，48h后停止培養(yǎng)，0.01mol L-1 PBS（pH7.4）洗2次，2.5g L-1 胰酶消化后離心，以700mL L-1 的冷乙醇制成1×10

6 L-1 密度單細(xì)胞懸液，30min后，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x ±s表示，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 寡核苷酸對VSMC增殖活力的影響 相同濃度（10μmol L-1 ）各種寡核苷酸對血管平滑肌作用24h后，各加藥組與空白對照組相比MTT A值無明顯差異（P>0.05），各加藥組之間也無明顯差異（P>0.05）;在加藥后48h反義組與空白組之間有顯著性差異（P0.05），5μmol L-1 以上濃度的PDGFR-βAODN對細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，表明PDGFR-βAODN增殖抑制作用有明顯的濃度依賴效應(yīng).

表1 寡核苷酸對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響　略

2.2 PDGFRβAODN對細(xì)胞周期的影響 與空白對照組相比10μmol L-1 AODN作用于VSMC24h后細(xì)胞G1 期（DNA合成前期）比數(shù)分?jǐn)?shù)達(dá)到0.70，而空白對照組G1 期細(xì)胞只占0.50明顯低于AODN組（P

2.3 PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)染色 空白對照組PCNA染色呈強(qiáng)陽性（Fig1A）;5μmol L-1 PDGFR-βAODN作用于VSMC48h后細(xì)胞PCNA染色呈陽性;10μmol L-1 以上AODN作用于VSMC48h后細(xì)胞PCNA染色呈陰性（Fig1B），陽性率與對照組比較有明顯差異（P

圖1 PCNA染色　略

表2 不同寡核苷酸對血管平滑肌細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響　略

表3 反義寡核苷酸濃度對血管平滑肌細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響　略

3 討論

PDGF對VSMC是一種強(qiáng)烈的促增殖劑和趨化劑，并且PDGF對VSMC的作用有一定的組織特異性［6］ .當(dāng)大量PDGF和β型受體結(jié)合后通過絡(luò)氨酸激酶啟動細(xì)胞的增殖信號，最終導(dǎo)致VSMC大量增生和再狹窄的發(fā)生［7，8］ .PDGF的主要作用是使細(xì)胞從非分裂狀態(tài)的G1 期進(jìn)入分裂周期，起著一種“獲能因子”（competence factor）的作用，其他生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）可以促進(jìn)細(xì)胞從G1 期進(jìn)入DNA合成期［9］ .反義寡核苷酸可以通過其特異的堿基序列與目的基因相結(jié)合阻止目的基因的表達(dá)［10］ .因此PDGFR-β反義寡核苷酸可以阻止VSMC的PDGFR-β蛋白的表達(dá)從而阻斷其與PDGF的結(jié)合，使細(xì)胞停留于G1 期，最終抑制VSMC的增殖.另外我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PDGFR-βAODN作用于VSMC24h對VSMC無明顯增殖抑制作用，這與AODN雖被細(xì)胞攝取，但尚未能與目的基因達(dá)到充分結(jié)合等原因有關(guān);過去的研究證明PCNA是DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂過程中DNA多聚酶最重要的輔助因子.PCNA位于細(xì)胞核內(nèi)，它的表達(dá)量與VSMC的增殖活力呈正相關(guān)［11］ .因此我們在實(shí)驗(yàn)中以PCNA的表達(dá)強(qiáng)度側(cè)面反映VSMC的增殖活力，結(jié)果間接證明了PDGFR-βAODN對VSMC增殖抑制作用.另外也有少數(shù)人認(rèn)為寡核苷酸的作用無需任何序列特異性，而是與各種生長因子或膜蛋白相結(jié)合，抑制細(xì)胞的遷移、增殖.這與目前大多數(shù)同仁的觀點(diǎn)不符，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也不相符.我們發(fā)現(xiàn)正義寡核苷酸和錯義寡核苷酸對VSMC的增殖均無明顯抑制作用.這說明寡核苷酸對細(xì)胞的影響有嚴(yán)格的序列特異性.

PDGFR-βAODN作為基因工程和分子生物學(xué)的產(chǎn)物對體外培養(yǎng)VSMC的增殖可以產(chǎn)生很大程度的抑制，另外因?yàn)樵摲戳x寡核苷酸對于VSMC具有一定的組織特異性，所以PDGFR-βAODN有望能在體內(nèi)成功抑制血管損傷后VSMC的異常增生和再狹窄的形成.

參考文獻(xiàn):

［1］Gonsalves C，Bandyk DF，Action AJ.Duplex features of vein grafts stenosis and the success of percutaneous transluminal an-gioplasty ［J］.J Endovasc Surg，1999;6:66-72.

［2］Espinola Klainc，Rupprecht HJ.Impact of restenosis10years after coronary angioplasty ［J］.Eur Heart J，1998;19:1047-1053.

［3］Zhu HL，Yang JX，Zhang WD，Cui Q，Chen WS.Correlation between extracellular matrix and stenosis of autologous vein grafts in rabbit mAel ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（5）:407-409.

［4］Hart CE，Clowes AW.Platelet derived growth factor and arteri-al response to injury ［J］.Circulation，1997;95:555-556.

［5］Zhao HL，Ling SX，Jia B，Li J，Zhang LL，Zhang SF.Inhibito-ry effects of salidroside on hypeoxia-induced proliferation of rab-bit pukmonary arterial smooth muscle cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（2）:186-190.

［6］Ren YS，Chen Q，Jia GL，Jing Y，Dong SZ.Expression ofβre-ceptor of palelet derived growth factor in human coronary artery ［J］.Di-si Jinyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（60）:652-655.

［7］Waltenberger J，Andreallecker D，Kroll J，F(xiàn)rank H，Mayr U，Jeffrey D，Donald B，F(xiàn)ujita D，Gazit A，Hombach V，Levitzki A，F(xiàn)rank-D，Bǒhmer.A dual inhibitor of platelet-derived growth factorβ-receptor and Src kinanse activity potently inter-feres with motogenic and mitogenic responses to PDGF in vascu-lar smooth muscle cells ［J］.Circ Res，1999;85:12-22.

［8］Tan SJ，Jin LR，Chen WC.Effect of kallikrein on PDGF-in-duced proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells ［J］.Shanghai Yixue（J Shanghai Med），1999;22:112-114.

篇10

【關(guān)鍵詞】 松果體； 褪黑素；替代治療；學(xué)習(xí)記憶；室管膜下區(qū)；神經(jīng)干細(xì)胞；增殖；大鼠

【Abstract】 Objective To investigate the effects of melatonin replacement therapy on the learning and memory as well as on the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone（SVZ） of the lateral ventricle in pinealectomized adult rats.Methods Thirty male Sprague-Dawely rats were randomly pided into three groups with ten rats per group： sham-operated，pinealectomized and melatonin-replacement therapy. After two days of operations，the rats in melatonin-replacement therapy group received daily peritoneal injection of melatonin（ 200μg/kg body weight，dissolved in 5ml of 5% ethanol-NaCl solution）for twenty one consecutive days; while the rats in sham-operated and pinealectomized groups were daily given the equal volume of vehicle under the same conditions. After sixteen days of operations，the rat performences in Morris water maze were detected for five consecutive days. Then the number of proliferating cell nuclear antigen immunoreactive （PCNA-IR） cell nuclei in the SVZ was counted.Results Navigation tests showed that the escape latency for finding the platform during training trials of pinealectomized rats was significantly longer than that of sham-operated or melatonin-replacement rats （P＜0.01）. Probe tests revealed that pinealeetomized rats had much worse knowledge of the platform’s prcise location than sham-operated or melatonin-replacement rats did （P＜0.01）. Similarly，the mumber of PCNA-IR cell nuclei in the SVZ of pinealectomized rats was significantly lower than that in sham-operated or melatonin-replacement rats （P＜0.01）. However，melatonin replacement therapy reversed the above parameters（P＜0.01），which nearly reached the levels of sham-operated rats（P＞0.05）.Conclusion The data for the first time demonstrate that pinealectomy reduces the level of endogenous melatonin，and impairs the learming and memory processes as well as the proliferation of neural stem cells in the SVZ，whereas exogenous melatonin replacement therapy can reverse these changes，indicating that melatonin plays an important role in maitaining the normal learning and memory processes as well as in augmenting the neurogenesis in SVZ; and that melatonin may promote the neurogenesis in SVZ via activation of melatonin receptors in both neural stem cells and astrocytes，thereby enhancing olfactary memory.

哺乳動物側(cè)腦室室管膜下區(qū)（subventricular zone ，SVZ）是腦內(nèi)終生存在神經(jīng)發(fā)生（neurogenesis）的一個主要部位，由此產(chǎn)生的神經(jīng)干細(xì)胞通過有絲分裂形成祖細(xì)胞（progenitor cell），后者遷移到嗅球，分化成新的中間神經(jīng)元，代替衰老或死亡的神經(jīng)細(xì)胞，使局部神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)得到不斷更新，從而發(fā)揮正常的嗅覺及嗅覺記憶功能［1］。褪黑素是主要由松果體合成和分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，已證實(shí)其不僅具有促進(jìn)胚胎個體發(fā)育及體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的功能［2，3］，而且還可提高學(xué)習(xí)記憶能力［4］。然而，迄今仍匱乏有關(guān)褪黑素對成年在體SVZ神經(jīng)發(fā)生及學(xué)習(xí)記憶影響的報(bào)道。為此，筆者最近進(jìn)行了研究并初步觀察到，松果體切除對成年大鼠SVZ神經(jīng)發(fā)生及學(xué)習(xí)記憶均產(chǎn)生類似的負(fù)性效應(yīng)［5］。為進(jìn)一步揭示褪黑素、神經(jīng)干細(xì)胞及學(xué)習(xí)記憶三者之間的內(nèi)在聯(lián)系，本研究通過觀察褪黑素替代治療對上述指標(biāo)的影響模式，為闡明學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制提供新的資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小鼠抗人PCNA單克隆抗體為DAKO公司產(chǎn)品；生物素結(jié)合IgG、鏈霉菌抗生物素-過氧化酶（SP）及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色試劑盒均為福州邁新公司產(chǎn)品；褪黑素為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 動物與分組 選用清潔級健康雄性Sprague-Dawely大鼠30只，8～10周齡，體重150～180g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為以下3組，每組10只：假手術(shù)、去松果體及褪黑素替代治療組。

1.3 動物模型的建立 參照袁群芳等的方法［4］，進(jìn)行松果體切除術(shù)，假手術(shù)除不切除松果體外，其余步驟與上述相同。所有動物在自然光暗周期的環(huán)境中分組飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。

1.4 替代治療方法 術(shù)后第2天開始進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)，褪黑素替代治療組的每只大鼠按200μg/kg 劑量將褪黑素溶于0.5ml的5%（V/V）乙醇-生理鹽水中，每天在固定時(shí)間（18：00 pm）腹腔注射1次，連續(xù)給藥21天。在相同條件下，每天給予假手術(shù)組和去松果體組的每只大鼠腹腔注射0.5ml的5%乙醇-生理鹽水，連續(xù)注射21天。

1.5 學(xué)習(xí)記憶能力的測定

1.5.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 于術(shù)后16天開始用Morris水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制，型號：DMS-2）測試，歷時(shí)4.5天，每天分上、下午2個時(shí)段，每只大鼠在每個時(shí)段測試4次，記錄大鼠每次自入水直至找到并爬上平臺所需的時(shí)間，即逃避潛伏期，如60s找不到平臺即記錄為60s，以此作為判斷大鼠學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。

1.5.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 在測試的第5天下午撤走平臺，將大鼠放入水中，通過電腦測試系統(tǒng)記錄大鼠在2min內(nèi)的游泳軌跡，計(jì)算出大鼠在原平臺象限的游泳距離占總游泳距離的百分比，以此作為判斷大鼠記憶能力的指標(biāo)。

1.6 組織切片制備 各組大鼠在完成測試學(xué)習(xí)記憶能力后，1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注100ml 生理鹽水，繼之灌注500ml的4%多聚甲醛固定液（0.1mol/L PB液配制，pH 7.4，4℃）。除去顱蓋骨，將頭部固定于腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜［6］，在前囟前1.6mm至前囟后4.8mm的范圍內(nèi)切取腦組織塊，置于相同的固定液后固定3h（4℃），轉(zhuǎn)至30%蔗糖溶液（0.01mol/L PBS配制，pH 7.4，4℃），待組織塊下沉后行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚40μm，隔3取1，收集于0.01mol/L PBS中，待反應(yīng)。

1.7 免疫組化反應(yīng) 采用SP法檢測SVZ的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen，PCNA）的表達(dá)，主要步驟如下：切片入3%（V/V）H2O2溶液室溫15min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；入0.1%（V/V）Triton X-100溶液（0.01 mol/L PBS配，pH 7.4）室溫孵育1h；正常羊血清室溫封閉抗原20min；小鼠抗人PCNA單克隆抗體（1:100）室溫孵育22h；生物素結(jié)合IgG室溫孵育2h；SP室溫孵育2h；0.05%DAB（含0.01%（V/V）H2O2）室溫顯色約30s。在上述過程中，完成每一步驟后均用0.01mol/L PBS（pH 7.4）漂洗15min，然后再進(jìn)行下一步驟。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。陰性對照實(shí)驗(yàn)除用羊血清代一抗外，其余步驟與上述相同。

1.8 細(xì)胞計(jì)數(shù) 每只動物選取3張切片（前囟前0.8mm、1.0mm、1.2mm）作為觀察對象［6］，光鏡下（40×10）計(jì)數(shù)左側(cè)側(cè)腦室SVZ的背側(cè)、外側(cè)及內(nèi)側(cè)3個視野的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用最小差異顯著性檢驗(yàn)（LST）及Games-Howell檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，以雙側(cè)α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)，最后得出的數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試結(jié)果 各組大鼠的逃避潛伏期及在原平臺象限游泳距離的百分比分別見表1及圖1。

從表1可見，除測試的第1時(shí)段外，去松果體組大鼠在其余測試時(shí)段的逃避潛伏期均比褪黑素替代治療或假手術(shù)組大鼠明顯延長，組間的差異有非常顯著性（P＜0.01），而褪黑素替代治療組大鼠與假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期較為接近，組間差異無顯著性（P＞0.05）。在整個測試中，去松果體、褪黑素替代治療及假手術(shù)組大鼠9個時(shí)段的平均逃避潛伏期分別為33.89、19.73及18.28s，其中去松果體組的平均逃避潛伏期分別比褪黑素替代治療組和假手術(shù)組明顯增加了71.8%和85.4%，組間差異有非常顯著性（P＜0.01），但褪黑素替代治療組與假手術(shù)組之間差異仍然無顯著性（P＞0.05）。

從圖1可見，去松果體、褪黑素替代治療及假手術(shù)組大鼠在原平臺象限游泳距離的百分比分別為18.7%、40.3%及45.8%；去松果體組大鼠分別比褪黑素替代治療組和假手術(shù)組大鼠明顯下降了53.6%和59.2%，組間差異有非常顯著性（P＜0.01），而褪黑素替代治療組與假手術(shù)組大鼠之間差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 PCNA陽性細(xì)胞的變化 SVZ的PCNA免疫反應(yīng)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，陽性細(xì)胞核為圓形、橢圓形或梭形，各組大鼠SVZ的PCNA陽性細(xì)胞核形態(tài)均無明顯差異。此外，用羊血清替代—抗的反應(yīng)結(jié)果也為陰性。對各組大鼠左側(cè)側(cè)腦室SVZ的PCNA陽性細(xì)胞核計(jì)數(shù)的結(jié)果見表2。

由表2可見，去松果體組大鼠SVZ的PCNA陽性細(xì)胞核數(shù)分別比褪黑素替代治療組及假手術(shù)組大鼠明顯下降了37.1%和38.8%，組間差異有非常顯著性（P＜0.01），而褪黑素替代治療組與假手術(shù)組之間則差異無顯著性（P＞0.05）。

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有高度增殖能力的原始細(xì)胞，為了解這類細(xì)胞的增殖狀態(tài)，常通過觀察其細(xì)胞周期中的標(biāo)志物變化來加以斷判之。PCNA既是屬于種系發(fā)生中高度保守的DNA多聚酶δ輔助蛋白，又是參加細(xì)胞DNA合成的一個不可或缺的蛋白因子［7］。PCNA定位于細(xì)胞核，在神經(jīng)干細(xì)胞增殖的DNA合成期中表達(dá)，且其表達(dá)水平與DNA合成的活躍程度呈正比［8］，故PCNA是研究神經(jīng)發(fā)生動力學(xué)的一個重要指標(biāo)。由于PCNA具有以上特點(diǎn)，故本研究用其來觀測神經(jīng)干細(xì)胞的增殖變化。

既往研究表明，在體外培養(yǎng)的新生大鼠SVZ神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)表皮生長因子刺激后，再加入褪黑素可明顯提高神經(jīng)干細(xì)胞的增殖率［2］，而且褪黑素還可加速個體胚胎生長和發(fā)育的進(jìn)程［3］，說明褪黑素對細(xì)胞發(fā)生及胚胎形成均產(chǎn)生明顯的正性效應(yīng)。由此可推測，褪黑素有可能對成年在體SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖施加某種影響。為探討這一問題，筆者最近做了相關(guān)研究，結(jié)果初步顯示，通過切除松果體消除內(nèi)源性褪黑素的主要來源，可明顯降低成年大鼠SVZ的PCNA陽性細(xì)胞核數(shù)（P＜0.01）［5］；本研究結(jié)果則顯示，褪黑素替代治療可使因去松果體下降的PCNA陽性細(xì)胞核數(shù)明顯升高到正常水平（P＜0.01）。因此，以上結(jié)果與其他作者的基本一致［2，3］，也充分證實(shí)了筆者的推測，即褪黑素對成年在體SVZ神經(jīng)干細(xì)胞具有促增殖作用，而且此作用呈現(xiàn)出對部位、細(xì)胞種類及發(fā)育階段的非依賴性。其作用機(jī)制可能與兩方面有關(guān)：（1）褪黑素直接作用于神經(jīng)干細(xì)胞上的相應(yīng)受體［3］，使PCNA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)更多的細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，為產(chǎn)生更多的子細(xì)胞提供了合成代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)；（2）褪黑素作用于局部星形膠質(zhì)細(xì)胞上的相應(yīng)受體［9］，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞相互作用并合成及釋放多種細(xì)胞生長因子，后者可保護(hù)子細(xì)胞完成遷移抵達(dá)終點(diǎn)以及分化成局部中間神經(jīng)元［10］，這對于完成使局部神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)得到不斷更新轉(zhuǎn)歸和整合以及維持功能的可塑性均有重要的生物學(xué)意義。

袁群芳等報(bào)道［4］，松果體源性褪黑素具有提高大鼠在Morris水迷宮的學(xué)習(xí)記憶能力。筆者前期的研究［5］、本研究亦表明，去松果體可使大鼠在Morris水迷宮的學(xué)習(xí)記憶能力下降（P＜0.01），褪黑素替代治療則可提高去松果體大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（P＜0.01），這與上述作者的相一致。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還首次顯示，在去松體或褪黑素替代治療狀態(tài)下，學(xué)習(xí)記憶的變化與PCNA陽性細(xì)胞核數(shù)的變化之間存在著驚人的相似之處，故兩者的變化趨勢呈現(xiàn)出平行關(guān)系。提示褪黑素很有可能通過前述的機(jī)制來提高SVZ的神經(jīng)發(fā)生，使神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生更多的祖細(xì)胞，經(jīng)吻側(cè)遷移途徑（rostral migratory stream）源源不斷地遷移到嗅球，最終分化成顆粒細(xì)胞和小球周細(xì)胞，從而提高嗅覺記憶功能［11］;也有可能通過促進(jìn)基底前腦膽堿能系統(tǒng)的功能來提高學(xué)習(xí)記憶能力［4］。至于是否另有提高學(xué)習(xí)記憶能力的其他機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究澄清。

臨床研究表明，嗅覺障礙是在老年性癡呆早期首發(fā)的主要癥狀之一，并隨病程進(jìn)展而加重［12］。此外，老年性癡呆患者腦脊液的褪黑素水平顯著下降，褪黑素分泌的節(jié)律性也明顯紊亂［13］。這些結(jié)果提示，在老年性癡呆的發(fā)病中，有可能由于褪黑素的合成和分泌減退以及節(jié)律異常，導(dǎo)致SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖嚴(yán)重受損，使嗅球需要更新的局部中間神經(jīng)元得不到及時(shí)補(bǔ)充，進(jìn)而引發(fā)嗅覺及嗅覺記憶功能障礙。因此，除了可用褪黑素調(diào)動原位SVZ神經(jīng)干細(xì)胞來防治老年性癡呆外，還可在用神經(jīng)干細(xì)胞移植或基因治療該病中宜添加褪黑素，使得移植的神細(xì)干細(xì)胞能有效分裂、整合到靶組織，目的基因也能長期表達(dá)產(chǎn)物，從而在該病的神經(jīng)結(jié)構(gòu)重建及功能恢復(fù)方面有可能獲得意想不到的效果。

1 Taupin P. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system: functionality and potential clinical interest. Med Sci Monit，2005，11（7）:247-252.

2 段發(fā)亮，陳俊拋.褪黑素對EGF作用后神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（7）：688-690.

3 Ishizuka B，Kuribayashi Y，Murai T，et al. The effects of melatonin on in vitro fertilization and embryo development in mice. J Pineal Res ，2000，28（1）:48-51.

4 袁群芳，何宏發(fā)，田榮波. 摘除松果體對大鼠學(xué)習(xí)記憶及基底前腦堿膽能系統(tǒng)的影響.解剖學(xué)研究，2003，25（1）：30-32.

5 郭靈，林丹，曾慶堂，等. 去松果體后成年大鼠學(xué)習(xí)記憶及側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的變化.解剖學(xué)研究，2005，27（4）：252-256.

6 包新民，舒斯云. 大鼠立體定位圖譜.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999.

7 Fukuda K，Morioka H，Imajou S，et al. Structure -function relationship of eukaryotic DNA replication factor，proliferating cell nuclear antigen. J Biol Chem，1995，270（38）:22527-22534.

8 Ion H ，Chiba T. Expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in the adult and developing mouse nervous system. Brain Res Mol Brain Res，2000，78（1-2）: 163-174.

9 Niles LP，Armstring KJ，Rincon Castro LM，et al. Nerual stem cells express melatonin receptors and neurotrophic factors :colocalization of the MT1 receptor with neuronal and glial markers.BMC Neurosci，2004，5（14）:41-49.

10 Lim DL，Alvarez-Buylla A. Interation between astrocytes and adult subventricular zone precursors stimulates neurogenesis. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（13）:7526-7531.

11 Gheusi G，Cremer H，Mclean H，et al. Importance of newly generated neurns in the adult olfactory bulb for odor discrimination. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（4）:1823-1828.